El ADN algunas técnicas para su determinación

Repaso teórico

¿Qué es el ADN Y qué el ARN?

Refresquemos algunas diferencias

Trabajo Práctico Nº 10

Tema: tecnología del ADN

FUNDAMENTO

El ADN recombinante, o ADN recombinado, es una molécula de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro por la unión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos distintos que normalmente no se encuentran juntos. Al introducirse este ADN recombinante en un organismo, se produce una modificación genética que permite la adición de una nueva secuencia de ADN al organismo, conllevando a la modificación de rasgos existentes o la expresión de nuevos rasgos. La producción de una proteínano presente en un organismo determinado y producidas a partir de ADN recombinante, se llaman proteínas recombinantes.

El ADN recombinante es resultado del uso de diversas técnicas que los biólogos moleculares utilizan para manipular las moléculas de ADN y difiere de la recombinación genética que ocurre sin intervención dentro de la célula. El proceso consiste en tomar una molécula de ADN de un organismo, sea virus, planta o una bacteria y en el laboratorio manipularla y ponerla de nuevo dentro de otro organismo. Esto se puede hacer para estudiar la expresión de un gen, para producir proteínas en el tratamiento de una enfermedad genética, vacunas o con fines económicos y científicos.

El proceso de producción de un ADN recombinante comienza con la identificación desde un organismo de una secuencia de ADN de interés con el fin de propagarlo en otro organismo que carece de la secuencia y, por ende, del producto proteico de esa secuencia de ADN. Así se pueden producir cantidades ilimitadas de la proteína codificada por el susodicho gen. En términos simples, el procedimiento consiste en:

·         Localización de genes y sus funciones.

·         Clonación del ADN, y su posterior almacenamiento en genes.

·         Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

·         Utilización de vectores de expresión.

PCR

https://es.wikipedia.org/wiki/ADN_recombinante

Una técnica utilizada para amplificar, o hacer muchas copias de, una región de ADN blanco en específico. Puntos más importantes:

·         La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica para hacer muchas copias de una determinada región de ADN in vitro (en un tubo de ensayo en lugar de un organismo).

·         La PCR depende de una ADN polimerasa termoestable, la Taq polimerasa, y requiere de cebadores de ADN diseñados específicamente para la región de ADN de interés.

·         En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de temperatura que permiten la producción de muchas copias de la región blanco.

·         La PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la práctica. Se utiliza de forma rutinaria en la clonación de ADN, el diagnóstico médico y el análisis forense de ADN.

¿Qué es la PCR?

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común utilizada para hacer muchas copias (¡millones o miles de millones!) de una región particular de ADN. Esta región de ADN puede ser cualquier cosa que le interese al experimentador. Por ejemplo, podría ser un gen cuya función quiere entender un investigador o un marcador genético usado por científicos forenses para relacionar el ADN de la escena del crimen con los sospechosos.

Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la región blanco para que pueda analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo, el ADN amplificado por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis en gel o clonar en un plásmido para otros experimentos.

La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina, como la investigación en biología molecular, el diagnóstico médico e incluso algunas ramas de la ecología.

 

La Taq polimerasa

Al igual que la replicación de ADN en un organismo, la PCR requiere de una enzima ADN polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el uso de las cadenas existentes como molde. La ADN polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria tolerante al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus).

T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN polimerasa es muy termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los 70°C (temperatura a la que la ADN polimerasa de ser humano o de E. coli no funcionaría). La Taq polimerasa es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad térmica. Como veremos, la PCR utiliza altas temperaturas repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus cadenas.

Cebadores para PCR

Al igual que otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa solo puede hacer ADN si hay un cebador, una corta secuencia de nucleótidos que proporciona un punto de partida para la síntesis de ADN. En una reacción de PCR, la región de ADN que será copiada, o amplificada, se determina por los cebadores que el o la investigadora elija.

Los cebadores para PCR son pedazos cortos de ADN de cadena sencilla, generalmente de unos 202020 nucleótidos de longitud. En cada reacción de PCR se utilizan dos cebadores que están diseñados para flanquear la región blanco (la región que debe ser copiada). Es decir, les agregan secuencias que harán que se unan a cadenas opuestas del molde de ADN solo en los extremos de la región a copiar. Los cebadores se unen al molde mediante complementariedad de bases.

Los pasos de la PCR

Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq polimerasa, cebadores, ADN molde y nucleótidos (los bloques básicos del ADN). Los ingredientes se colocan en un tubo, junto con los cofactores que necesite la enzima, y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento que permiten la síntesis del ADN.

Los pasos básicos son:

1.     Desnaturalización (96°C): la reacción se calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso.

2.     Templado (555555 - 656565°C): la reacción se enfría para que los cebadores puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.

3.     Extensión (72°C): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taqpolimerasa extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN.

Este ciclo se repite 252525 - 353535 veces en una reacción de PCR típica, que generalmente tarda 222 - 444 horas, según la longitud de la región de ADN que se copia. Si la reacción es eficiente (funciona bien), puede producir miles de millones de copias a partir de una o unas cuantas copias de la región blanco.

Eso es porque no solo se usa el ADN original como molde en cada ciclo. En realidad, el nuevo ADN que se produce en una ronda puede servir como molde en la siguiente ronda de síntesis de ADN. Hay muchas copias de los cebadores y muchas moléculas de Taq polimerasa flotando en la reacción, por lo que el número de moléculas de ADN casi puede duplicarse en cada ciclo. La siguiente imagen muestra este patrón de crecimiento exponencial.

Uso de la electroforesis en gel para visualizar los resultados de una PCR

Habitualmente, los resultados de una reacción de PCR se visualizan (se hacen visibles) al usar electroforesis en gel. La electroforesis en gel es una técnica en la que una corriente eléctrica impulsa fragmentos de ADN a través de una matriz de gel y los fragmentos de ADN se separan según su tamaño. Típicamente se incluye un estándar, o marcador de peso molecular, para que pueda determinarse el tamaño de los fragmentos en la muestra de PCR.

Los fragmentos de ADN de la misma longitud forman una "banda" en el gel que se puede identificar a simple vista si el gel se tiñe con un pigmento que se una al ADN. Por ejemplo, una reacción de PCR que produce un fragmento de 400400400 pares de bases (pb) se vería así en un gel:

Carril izquierdo: marcador de ADN con bandas de 100, 200, 300, 400 y 500 pb.

Carril derecho: resultado de la reacción de PCR, una banda de 400 pb.

Una banda de ADN contiene muchas, muchas copias de la región blanco de ADN, no solo una o unas cuantas copias. Dado que el ADN es microscópico, deben existir muchas copias de este para poder verlo a simple vista. Esto es una parte importante de por qué la PCR es una herramienta importante: produce suficientes copias de una secuencia de ADN para poder ver o manipular esa región de ADN.

Aplicaciones de la PCR

Mediante el uso de la PCR, una secuencia de ADN se puede amplificar millones o miles de millones de veces y producirá suficientes copias de ADN para que se analicen mediante otras técnicas. Por ejemplo, el ADN se puede visualizar por electroforesis en gel, enviar a secuenciar o digerir con enzimas de restricción y clonar en un plásmido.

La PCR se utiliza en muchos laboratorios de investigación, y también tiene aplicaciones prácticas en medicina forense, pruebas genéticas y diagnósticas. Por ejemplo, la PCR se utiliza para amplificar genes asociados con trastornos genéticos a partir del ADN de los pacientes (o de ADN fetal, en el caso de pruebas prenatales). La PCR también puede utilizarse para detectar el ADN de una bacteria o un virus en el cuerpo de un paciente: si el patógeno está presente, es posible amplificar regiones de su ADN de una muestra de sangre o tejido.

Problema de ejemplo: la PCR en ciencias forenses

Imagina que trabajas en un laboratorio forense. Acabas de recibir una muestra de ADN de un cabello encontrado en la escena de un crimen junto con muestras de ADN de tres posibles sospechosos. Tu trabajo es examinar un marcador genético determinado y ver si alguno de los tres sospechosos coincide con el ADN del cabello para este marcador.

El marcador se presenta en dos alelos o versiones. Uno contiene una secuencia repetida una vez (región marrón en la siguiente imagen) y el otro contiene la secuencia repetida dos veces. En una reacción de PCR con cebadores que flanquean la región con las secuencias repetidas, el primer alelo produce un fragmento de ADN de 200200200 \text{pb}pbp, b y el segundo produce un fragmento de 300300300 \text{pb}pbp, b:

Alelo marcador 1: los cebadores que flanquean la región de secuencias repetidas amplifican un fragmento de 200 pb de ADN.

Alelo marcador 2: los cebadores flanquean la región de repetidas amplifican un fragmento de 300 pb de ADN

Realizas PCR para las cuatro muestras de ADN y visualizas los resultados por electroforesis en gel, como se muestra a continuación:

El gel tiene cinco carriles:

Primer carril: marcador de ADN con bandas de 100, 200, 300, 400 y 500 pb.

Segundo carril: ADN de la escena del crimen, banda de 200 pb.

Tercer carril: ADN del sospechoso #1, banda de 300 pb.

Cuarto carril: ADN del sospechoso #2, bandas de 200 y 300 pb.

Quinto carril: ADN del sospechoso #3, banda de 200 pb.

¿Cuál es el sospechoso cuyo ADN coincide con el de la escena del crimen para este marcador?

Más sobre PCR y análisis forense

En pruebas forenses reales de ADN para una escena del crimen, los técnicos harían un análisis conceptualmente similar al del ejemplo anterior. Sin embargo, se compararía un número de diversos marcadores (no solo un marcador como en el ejemplo) entre el ADN de la escena del crimen y el ADN de los sospechosos.

Además, los marcadores utilizados en un análisis forense típico no tienen solo dos formas diferentes. Por el contrario, son altamente polimórficos (poli = muchos, morfo = forma). Es decir, se presentan en muchos alelos que varían en pequeños incrementos de longitud.

El tipo de marcador más usado en el análisis forense, llamado repeticiones cortas en tándem (STR, por sus siglas en inglés), consiste en muchas copias repetidas de la misma secuencia corta de nucleótidos (de 222 a 555 nucleótidos de largo, por lo general).

Al examinar múltiples marcadores, cada uno de los cuales presenta muchas formas alélicas, los científicos forenses pueden construir una "huella dactilar" genética única a partir de una muestra de ADN. En un análisis típico de STR que utiliza 131313 marcadores, la probabilidad de un falso positivo (que dos personas tengan la misma "huella dactilar" de ADN) ¡es menor a 111 en 101010.

Aunque se pueda pensar que las pruebas de ADN se usan para condenar a los criminales, también han jugado un papel crucial en exonerar personas falsamente acusadas (incluso algunas que tenían muchos años encarceladas). El análisis forense también se usa para determinar paternidad y para identificar restos humanos en escenas de desastre.

https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr

Aplicaciones

El vector que se utiliza contiene secuencias de ADN que al ser replicadas confieren resistencia a antibióticos específicos. Esta técnica ha sido ampliamente utilizada en el campo de la medicina y ha permitido el desarrollo de importantes avances terapéuticos como por ejemplo la producción de insulina recombinante.²​

Permite además la posibilidad de utilizar plantas y alimentos transgénicos, así como microorganismos modificados genéticamente para producir fármacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtención de nuevas vacunas o la clonación de animales.

Con el uso de ADN recombinante se ha logrado obtener plantas transgénicas resistentes a insectos, hongos, bacterias y herbicidas, con mejores características de calidad durante poscosecha y con alto contenido nutricional.⁴​ También ha permitido la clonación, expresión y producción mediante esta técnica de diversos antígenos, por ejemplo, la vacuna contra la hepatitis B⁵​ y la vacuna contra el virus del papiloma humano.⁶​

Producción y terapia con proteínas recombinantes

Las proteínas recombinantes son aquellas que se producen mediante la técnica del ADN recombinante, es decir, expresando un gen de un organismo en otro organismo distinto. Para que estas proteínas sean útiles desde el punto de vista terapéutico tienen que conservar su actividad. Además, se debe evitar que sean inmunogénicas para el ser humano. Para ello es importante decidir para cada proteína recombinante cual es el organismo de expresión más adecuado.

Producción en bacterias

Estas proteínas recombinantes han intentado expresarse en bacterias como E. coli, ya que son fáciles de mantener, crecen rápido y se conoce bien su genoma. Sin embargo, el mayor problema que presenta la producción en bacterias es que en ellas no existe glicosilación proteica, por lo que algunas proteínas producidas en bacterias pierden totalmente su función. Aun así se han logrado producir con éxito algunas proteínas recombinantes en bacterias. La primera proteína recombinante que se produjo en E. coli fue la somatostatina, una hormona anti-crecimiento de 14 aminoácidos. Sin embargo, aunque desde el punto de vista científico fue un éxito, desde el punto de vista económico fue un fracaso, ya que su utilidad estaba reducida a personas con problemas de gigantismo y similares, que son poco comunes. Posteriormente se logró un gran éxito en este campo mediante la producción de insulina en bacterias. La insulina presenta la ventaja de no necesitar modificaciones postraduccionales, por lo que se evita este problema de su producción en bacterias. Además, la diabetes es una enfermedad muy frecuente en la sociedad, con unos 347 millones de diabéticos. En EEUU el 6% de la población (20 millones de habitantes) son diabéticos y esta enfermedad es la 6ª causa de muerte. Antes de esta producción en bacterias, se usaba insulina porcina.

Producción en levaduras

Al ser células eucariotas y por lo tanto más similares a las humanas que las bacterias y ser muy fáciles de emplear industrialmente, las levaduras constituyen otro grupo de organismos susceptibles de producir proteínas recombinantes para uso humano. Sin embargo, aunque sí presentan glicosilación proteica, al contrario que las bacterias, esta es totalmente distinta a la humana, por lo que estas proteínas presentan problemas, en muchos casos incluso inmunogénicos.

Producción en células de insecto

Más cercanas aún a las células humanas que las levaduras son las de insecto, como las de Spodoptera frugiperda (una polilla parásito del maíz y del algodón), que se cultivan fácilmente in Vitro, aunque el medio de cultivo es caro. Dicho medio, además, no contiene suero, lo que hace más fácil el procesado de la proteína. Otra de las propuestas ha sido el uso no de células de insecto, sino de los insectos completos para la producción de estas proteínas. Para ello se infectan a los insectos con baculovirus modificados (que además no infectan a los seres humanos) para que expresen la proteína recombinante. Sin embargo, este sistema presenta exactamente el mismo problema que el de levaduras: que las células de insecto presentan glicosilación, pero esta es totalmente distinta a la de mamíferos.

Producción en células de mamífero

Al ser células más parecidas a las humanas, el procesamiento que sufren las proteínas recombinantes producidas en células de mamífero también es más similar, por lo que se conserva su función (aunque puede haber ligeros cambios en el patrón de glicosilación). Los inconvenientes de este método es que el crecimiento celular es más lento, tardando de 6 a 24 horas en duplicarse las células, que los cultivos pueden sufrir contaminación de bacterias u hongos y que se puede contaminar el producto con virus que infecten a humanos. Para la producción en mamíferos se usan las células CHO, de ovario de ratón chino, que presentan la ventaja de que crecen bien y existen gran cantidad de mutantes de glicosilación. Además, se está intentando que los animales secreten estas proteínas en la orina, en la leche, etc.

https://es.wikipedia.org/wiki/ADN_recombinante

Observaciones : no se han podido pegar imágenes explicativas

 que se podrán observar en el apunte de aula. La profe