FUNDAMENTO
Por la
estructura peptídica y la presencia de determinados grupos (grupos R), las
proteínas pueden reaccionar con una variedad de agentes originándose productos
coloreados. Estas reacciones son la base para la determinación cuantitativa y
cualitativa de las proteínas.
Por
presentarse variaciones en la composición de los aminoácidos de las diferentes
proteínas, se manifiestan diferentes colores y grados de intensidad para una
misma reacción, íntimamente relacionado con la naturaleza de la proteína
analizada.
1) Prueba de la
ninhidrina (Hidrato de tricetohidrindeno).
Todas
aquellas sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno carboxilo
libre, reaccionaran con la ninhidrina. La positividad se manifiesta por la
aparición de un color violáceo o amarillo.
Debido
a que las proteínas y los aminoácidos, poseen esta característica, la reacción
sirve para identificarlos.
Algunas
soluciones de amonio y aminas, dan la coloración característica, aparentemente
debido a una oxidación y reducción intramolecular de la ninhidrina en presencia
de amoníaco.
Los
aminoácidos prolina e hidroxiprolina, que no poseen grupo amino sino imino
(-NH-), dan un color rojo que pasa rápidamente a amarillo. La reacción es:
Según vídeo: ¿Qué AA y proteínas dan positivo Ninhidrina y por qué? ¿Cómo se manifiesta el +? ¿Y el negativo?
Anota
2) Prueba de
Biuret
Es una prueba general para polipéptidos y proteínas ya
que sirve para reconocer las uniones peptidicas.
La positividad se manifiesta por la aparición de una
coloración violeta, debida a la formación de un complejo de coordinación entre
los cationes cúpricos en medio alcalino con las uniones peptídicas.
Según vídeo: ¿Qué AA y/o proteínas dan positivo Biuret y por qué? ¿Cómo se manifiesta el +? ¿Y el negativo?
3) Prueba de coagulación:
Es una prueba para identificar: albúminas, globulinas,
gluteninas y prolaminas.
La positividad se manifiesta por la formación de un
coágulo. No se conoce exactamente el mecanismo de reacción, se cree que ocurre
cierta deshidratación de la molécula proteica.
Busca en esta página web: ¿Qué reactivos se pueden usar y cómo se manifiesta el positivo? ¿Y el negativo?
Anota
4) Prueba de Sulfato de amonio:
Las proteínas, como otros coloides son precipitadas por
soluciones concentradas de sales de amonio, como, por ejemplo, [NaCl. (NH4)2SO4 y
NaSO4 ].
Aparentemente la precipitación se debe a la neutralización y deshidratación de
la molécula, seguida de agregación y precipitación.
Busca en esta página web: ¿ Cómo se manifiesta el positivo? ¿Y el negativo?
Anota
5) Prueba xantoproteica:
Es una reacción que reconoce los aminoácidos que poseen
el grupo bencenico (tirosina, fenilalanina, triptófano). Las proteínas que
tienen en su composición estos aminoácidos también darán la reacción. La
positividad se reconoce por la aparición de un color amarillo o verde debido a
la formación de nitrocompuestos.
Según vídeo: ¿Qué AA y/o proteínas dan positivo la prueba Xantoproteica y por qué? ¿Y el negativo? ¿Cómo se manifiesta el +?
6) Prueba de los grupos SH:
Es una prueba para identificar aminoácidos azufrados y
las proteínas que los contienen. Se reconocen por la formación de una
coloración negra o gris. La figura siguiente muestra dicha reacción.
Según vídeo: ¿Qué AA y/o proteínas dan positivo esta reacción y por qué?¿Y el negativo? ¿Cómo se manifiesta el +?
7) Prueba de Sakaguchi:
Es una prueba para identificar arginina y se usa para
identificar proteínas ya que casi todas las proteínas poseen ese aminoácido. El
desarrollo de un color rojo marca la reacción positiva y se debe a la presencia
del grupo guanidina, que caracteriza la arginina
Según vídeo: ¿Qué AA y/o proteínas dan positivo esta reacción y por qué?¿Y el negativo? ¿Cómo se manifiesta el +?
8) Prueba de
Hopkins-Cole:
Es para identificar el triptófano y las proteínas que lo contienen.
La positividad se reconoce por la aparición de un anillo color
violeta-rojizo. La reacción es la siguiente
Según vídeo: ¿Qué AA y/o proteínas dan positivo esta reacción y por qué? ¿Y el negativo?¿Cómo se manifiesta el +?
9) Prueba de
Millon
La reacción es debida a la presencia del grupo
hidroxifenílico (-C6H4OH) en la molécula proteica. Cualquier
compuesto fenólico no sustituido en la posición 3,5, como la tirosina, fenol y
timol, dan positiva la reacción. El
mecanismo de la reacción es poco conocido, posiblemente se deba a la formación
del complejo oxido de mercurio y fenol.
2. A continuación se detalla cómo hubiésemos trabajado en el Laboratorio de la escuela, usando ciertas muestras particulares. Esta parte, se incorpora al TP para que se puedan identificar fundamentalmente los REACTIVOS de las experiencias.
MATERIALES
a.- Materiales
-
Solución de albúmina
-
Solución de gelatina
-
Gelatina hidrolizada
- Tubos de ensayo
- Mechero
- Pinzas de madera
- Soluciones de los reactivos preparados como se indica
b.- Preparación
de una solución de albúmina
Se prepara una solución de albúmina batiendo la clara de un
huevo unos instantes y agregándole después cinco veces su volumen en agua. La
mezcla se filtra a través de una estopilla, recogiendo el líquido filtrado para
realizar las pruebas.
c.- Preparación de la
solución de gelatina
Se utiliza gelatina sin sabor y se hidrata con agua destilada
fría y si es necesario se agrega agua caliente hasta que la solución se vuelva
translúcida.
3.
PROCEDIMIENTO
|
ENSAYO |
PROCEDIMIENTO |
|
1) NINHIDRINA al 1% |
1 ml de sustancia problema + 1 ml del reactivo Calentar a ebullición por 1 min. Dejar enfriar y observar |
|
2) BIURET |
1 ml de sustancia problema + 1ml de NaOH al 10% + solución al
0,5% de CuSO4 agregada gota a gota, con agitación, hasta aparición
de un color violeta, azul o amarillo. El color violeta indica ensayo positivo |
|
3)
COAGULACIÓN |
2 ml de sustancia problema + 4 gotas de
ácido acético al 30% + 1 ml de solución saturada de NaCl Mezclar bien y calentar por 1 min La aparición de un enturbiamiento indica ensayo positivo |
|
4) REACCIÓN CON SULFATO DE AMONIO |
1 ml de sustancia problema + 1 ml de
solución al 50% de sulfato de amonio. Mezclar bien y dejar reposar. Luego
centrifugar. La aparición de un ppdo indica ensayo positivo |
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5) REACCIÓN XANTOPROTEICA |
1 ml de sustancia problema + 0,5 ml de ácido
nítrico concentrado Mezclar, calentar y observar. |
|
6) REACCIÓN DEL GRUPO SH |
1 ml de sustancia problema + 1 ml de NaOH al
40% + 1 ml de acetato plumboso. Mezclar bien y calentar. Observar |
|
7) REACCIÓN DE SAKAGUCHI |
2 ml de sustancia problema + 5 gotas de NaOH
al 40% + 8 gotas de naftol alcohólico + 10 gotas de NaClO al 2%. Mezclar bien y observar |
|
8) HOPKINS-COLE |
1 ml de sustancia problema + 3 ml de
reactivo de Hopkins-Cole + 1 ml de H2SO4 conc.,
deslizado por las paredes del tubo. Observar |
|
9) REACCIÓN DE MILLON |
2 ml de sustancia problema + 4 gotas de
reactivo de Millon. Observar |
a) Realiza un cuadro donde incluyas:
cada uno de los test trabajados en este práctico,
cuáles son los reactivos
qué sustancias reconoce
cómo se manifiesta el + POSITIVO.
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