Actividad: lee atentamente esta publicación y realiza un informe, para entregar, de 2 páginas A4. Donde explique los fundamentos de la técnica de electroforesis, tipos y aplicaciones propuestas.
Fecha de límite de entrega: 18/abril/2020.
Trabajo
Práctico Nº 9
Fundamentación: La mayoría de las biomoléculas poseen una
carga eléctrica, cuya
magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran.
Como consecuencia, se desplazan cuando se ven sometidas a un campo eléctrico.
Se denomina electroforesis a la técnica
mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas
a un campo eléctrico. Se trata de una técnica fundamentalmente analítica,
aunque también se puede realizar con fines preparativos.
Cada molécula se desplaza por efecto del
campo, alcanzando rápidamente una velocidad constante al equilibrarse la fuerza
impulsora (fuerza del campo eléctrico) con la resistencia al avance (fuerza de
fricción o rozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza.
Fuerza del campo eléctrico = Fuerza
de fricción
q⋅E
= f⋅v
q = carga (C) v = velocidad de la molécula (m/s)
E = intensidad del campo (V/m = N/C) f = coeficiente de fricción (C·V·s / m2 =
kg/s)
El coeficiente de fricción
mide la resistencia intrínseca debida a las características de cada molécula,
siendo éstas esencialmente su forma y su tamaño. Así, por ejemplo, las
moléculas grandes y de forma irregular poseen un mayor coeficiente de fricción
que las pequeñas y compactas.
En unas condiciones
determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada molécula
definirá su separación en el espacio; al ir transcurriendo el tiempo, se van
separando progresivamente unas de otras.
Al ser el medio de soporte a
su vez un polielectrolito, está constituido por iones, que son atraídos y así
recubren los iones de la muestra, lo que altera el comportamiento de éstos en
el campo. Todo ello hace que el tratamiento teórico cuantitativo de la
electroforesis sea muy difícil y que esta técnica resulte poco útil para
obtener información precisa sobre la estructura de las moléculas. Sin embargo,
es enormemente útil como técnica analítica y preparativa.
Se suele hablar de 3 tipos de
electroforesis:
De frente móvil: los
componentes de la muestra están presentes en toda la disolución y se determina
ópticamente la posición del frente de avance o frontera con el disolvente.
Zonal: la muestra se aplica
como una mancha o banda y sus componentes migran a través de un disolvente,
utilizando además un medio que da soporte a éste. En este caso no se determina
la movilidad, sino que el único objetivo de la técnica es separar los componentes
de la muestra.
Continua: la muestra se aplica
también en una zona, pero se suministra continuamente a lo largo del proceso
(para más información, véanse las pp.250-2 de Freifelder, 1999).
Estudiaremos únicamente la
electroforesis zonal, de uso más extendido.
Finalmente, debe señalarse
que, aunque es menos frecuente, también se puede aplicar la electroforesis para
la separación de células.
Medios de soporte
para realizar la electroforesis
La muestra debe situarse en o
sobre un medio soporte, principalmente para evitar perturbaciones mecánicas y
corrientes de convección durante la separación. En algunos soportes (papel o
similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de ella,
con escasa fricción, por lo que el mecanismo principal de separación es la
magnitud de la carga de cada componente de la muestra. Otros medios de soporte
(“geles”, medios semisólidos o gelatinosos) están formados por polímeros que
forman una malla, matriz o red tridimensional a través de la cual deben avanzar
las moléculas de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte
electroforético. Como consecuencia, la fricción es notable y los factores de
forma y tamaño adquieren una alta relevancia en la separación.
Medios de baja fricción Medios
de elevada fricción
papel
acetato de celulosa gel
de almidón
gel de agarosa gel
de poliacrilamida
gel de agarosa+poliacrilamida
separación principalmente por
carga separación por carga, tamaño y
forma
Papel: sencillo, pero con elevada adsorción debido
a los grupos hidroxilo de la celulosa.
Acetato de
celulosa: los grupos –OH
están acetilados, lo que reduce la adsorción; baja tinción de fondo; es posible
transparentarla o disolverla para detectar y recuperar, respectivamente, los
componentes separados.
Almidón: pasta de almidón cuyos granos se han
disgregado en un tampón caliente (se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha
sido sustituido por la poliacrilamida.
Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas
(composición similar al agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60°C) y al
enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad.
poliacrilamida
acrilamida
Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerización
química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentración
de ambas y su proporción se consiguen distintas porosidades, siempre menores
que la de los geles de agarosa.
acrilamida: estructura química de la acrilamida (forma polímeros lineales)
N,N’-metileno-bis(acrilamida): estructura química de la bisacrilamida (introduce
uniones cruzadas entre cadenas de poliacrilamida)
poliacrilamida:
(vista parcial) estructura de una porción de poliacrilamida
Agarosa+poliacrilamida: se
consigue una porosidad intermedia.
Poliacrilamida con SDS: el
dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulphate; sinónimo: laurilsulfato sódico)
es un detergente aniónico que se une a las proteínas, desnaturalizándolas en
una conformación extendida recubierta de moléculas de SDS. Como consecuencia,
el tamaño de la molécula de proteína es directamente proporcional a su longitud
en aminoácidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS que la
recubre, que es también proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad
electroforética de la proteína depende exclusivamente de su masa molecular.
Modos de disposición del soporte
Horizontal
En papel, para aminoácidos u
otras moléculas pequeñas; en soportes similares (especialmente, acetato de
celulosa), para proteínas.
En gel de almidón o de
agarosa, para proteínas y especialmente para ácidos nucleicos. Casi siempre el
tampón cubre el gel (para evitar que se seque debido al calentamiento sufrido
al pasar la corriente), denominándose por ello “electroforesis submarina”.
El soporte se impregna por
capilaridad de disolución tampón, que disuelve la muestra y mantiene el contacto
eléctrico.
Se aplica la muestra
depositándola (con pipeta o un aplicador específico) como una gota sobre el
soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un “pocillo” creado en el gel.
Vertical: Se usa casi exclusivamente con gel de poliacrilamida
(más resistente físicamente, no se desliza), para proteínas o para ácidos
nucleicos de pequeño tamaño.
El gel puede rellenar tubos de vidrio (este
formato ya apenas se usa) o estar contenido entre 2 placas rectangulares.
Contacto eléctrico y
disolvente gracias al tampón que embebe el gel y llena las cubetas o
compartimentos del ánodo y cátodo.
La muestra se deposita con
micropipeta llenando un “pocillo” creado al polimerizar el gel.
En cuanto a la composición del
gel hay dos variantes: electroforesis continua (un solo tipo de gel) y
electroforesis discontinua (2 tramos de gel de composición ligeramente
diferente).
Aplicaciones:
1)
Electroforesis de proteínas séricas en acetato de celulosa.
En esta se realiza un reconocimiento cuanti y cualitativo. Dentro de las
proteínas séricas encontraremos distintos grupos de proteínas clasificadas
como:
Albúmina
α 1 globulinas
α 2 globulinas
b globulinas
g globulinas
2)
Electroforesis de ADN. La electroforesis en geles
de agarosa o poliacrilamida es una de las metodologías más utilizadas en el
laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con ácidos nucleicos.
Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN y ARN en función
de su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma
determinar el contenido de ácidos nucleicos de una muestra, teniendo una
estimación de su concentración y grado de entereza. Podemos además extraer del
gel los fragmentos de ADN que sean de interés, para posteriormente utilizarlos
en diferentes aplicaciones.
La electroforesis de ADN puede realizarse en geles de agarosa
o de poliacrilamida.
Los geles de agarosa tienen un poder de resolución mucho
menor que los de poliacrilamida, porque no permiten separar moléculas de ADN
que difieren en tamaño menos de unas 50 pb.
3)
Electroforesis de Aminoácidos.
En la electroforesis, los A.A. se colocan en un medio
tamponado de PH característico, donde adquirirán una determinada carga de
acuerdo con la naturaleza ionizable de sus grupos funcionales. Los A.A.
emigrarán hacia el polo negativo ( cátodo) o al electrodo opuesto llamado ánodo
(polo positivo) si están cargados negativamente, o no se desplazarán si la
carga neta de ese A.A. es nula.
Uno de los tampones usados habitualmente es el piridina/ác.
Acético glacial/ agua de PH= 6,1.
Los distintos A.A. poseen distintos Puntos Isoeléctricos.
Ejemplo: Gly (5,97), Leu (5,98), Asp (2,77), Lys ( 9,74).-
Metodología de trabajo:
A.
Aplicación de las muestras: se traza con un papel una línea débil en el
centro del papel distribuyendo en el espacio equitativamente los puntos de
siembra.
B.
Se señala en el margen superior derecho de la tira de papel
el signo (+) para indicar el extremo del papel que se va a situar en el compartimento de la cubeta que va a
actuar como ánodo.
C.
Se aplican las muestras.
D.
Se rocía el papel con la solución tampón de electroforesis
mediante el pulverizador, procurando no mojar directamente las muestras.
E.
Se toma el papel con pinzan y se coloca sobre la cubeta. ( el
papel debe estar bien humedecido)
F.
El extremo + debe coincidir con el ánodo.
G.
Se coloca la fuente de alimentación y se enciende la
misma.(300V)
H.
Se deja correr media hora, se apaga la fuente, se saca el
papel con pinzas, procurando no romperlo y se coloca sobre un papel de filtro
en la mesa de laboratorio.
I.
Se airea el papel para que se seque.
J.
Con pinzas de madera, se sumerge en solución de Ninhidrina y
luego se saca.
K.
Se espera hasta que se produce la reacción color ( púrpura)
L.
Interpretación de los resultados: Los aminoácidos contenidos
en la muestra problema se comparan con los desplazamientos de A.A. patrones.
Preguntas:
I.
¿Si el PH del tampón fuera 2 ¿Cuál sería el resultado de la electroforesis?
II.
¿Se podría identificar mediante esta técnica una mezcla de
los A.A. valina y triptófano utilizando las
mismas condiciones de la
práctica?
HEMOGLOBINA: La hemoglobina es una proteína que se
encuentra en disolución en el citoplasma del hematíe. Y dentro de cada hematíe
se encuentran unas 600 millones de moléculas de esta proteína, cuya función
principal es la de fijar de forma reversible el oxígeno molecular (O2), facilitando su transporte
desde los pulmones a los tejidos.
GRUPO HEMO
La molécula de hemoglobina está compuesta por
un grupo protéico y un grupo prostético. El grupo protéico está conformado por
cuatro cadenas de globina. Y el grupo prostético está conformado por cuatro
grupos hemo.
Cada grupo hemo está unido a
una cadena de globina. Y a su vez, las cadenas de globina están unidas entre sí
formando una estructura cuaternaria. Las uniones globina-globina se realizan a
través de uniones entre aminoácidos, que pueden ser de dos tipos:
Enlaces fuertes: entre
35 aminoácidos (α1 – β1 y α2 – β2).
Enlaces débiles: entre
19 aminoácidos (α1 – β2 y α2 – β1).
En el centro de la
molécula se sitúa el 2,3 difosfoglicerato (2,3 DPG), cuya función es la de
regular la función de la hemoglobina.
Cada molécula de
globina dispone de un repliegue donde se aloja el grupo hemo. La unión del
grupo hemo con la globina se realiza a través de dos mecanismos:
Mediante enlaces entre
las cadenas laterales de ácido propiónico del grupo hemo y la cadena de
globina.
Por el hierro, que
dispone de dos valencias libres. Una fija directamente la globina sobre un
residuo de histidina, y la otra, por el lado opuesto, se une a una molécula de
oxígeno. Y éste, a su vez, se une a otro residuo de histidina.
Estructura de la
globina
Las cadenas de globina
son polipéptidos formados por una determinada cantidad de aminoácidos. Existen
6 tipos diferentes de cadenas de globina:
Alfa (α)
Beta (β)
Gamma (γ)
Delta (δ)
Épsilon (ε)
Zeta (ζ)
Cada una de ellas
cuenta con un número determinado de aminoácidos. Por ejemplo, las cadenas α
poseen 141 aminoácidos, mientras que las β, γ y δ poseen 146 aminoácidos.
Las cadenas de globina
poseen estructura primaria, secundaria y terciaria. Solo logran la estructura
cuaternaria, característica de la hemoglobina, cuando se unen cuatro cadenas de
globina. El tetrámero globínico está conformado por la unión de cadenas de
globina con estructura terciaria.
En la estructura
terciaria de la globina surge el hueco donde se va a llevar a cabo la unión del
grumo hemo con la globina.
Estructura del grupo
hemo: El grupo hemo conforma el grupo prostético (no protéico) de la hemoglobina
y es el responsable de su color rojo característico.
Está compuesto por la
protoporfirina IX, en cuyo centro se sitúa el ión ferroso (Fe+2). La
protoporfirina IX, a su vez, está compuesta por cuatro anillos pirrólicos.
El ión ferroso es
hexacovalente, con seis valencias, teniendo seis nexos de unión. Cuatro de
ellos están unidos a la protoporfirina IX, concretamente a los cuatro
nitrógenos de sus anillos pirrólicos. Las dos valencias libres, como hemos
visto anteriormente, se unirán a la globina y al oxígeno molecular (O2). La
unión con el oxígeno es reversible.
Para que el átomo de
hierro pueda fijar el oxígeno, es necesario que se encuentre reducido (ión
ferroso Fe2+). Si se encuentra oxidado (ión férrico Fe3+)
el grupo hemo perderá la capacidad de fijar el O2, perdiendo la hemoglobina, de
este modo, su función respiratoria.
La hemoglobina con ión
férrico, y sin función respiratoria, recibe el nombre de metahemoglobina. En
condiciones fisiológicas, tan solo un 1% de la hemoglobina total es metahemoglobina.
Si la cantidad de metahemoglobina supera el 1% se dice que existe una
metahemoglobinemia.
Tipos de hemoglobina: Vimos con
anterioridad la existencia de 6 cadenas diferentes de globina. Cada molécula de
hemoglobina posee cuatro de estas cadenas, iguales dos a dos. Es decir, en cada
molécula de hemoglobina hay dos tipos de cadena de globina diferentes.
La combinación de estas cadenas entre sí dan lugar a
los seis tipos de hemoglobina normales:
La hemoglobina A es la
predominante en una persona adulta, constituyendo el 96-98% de la hemoglobina
total. La hemoglobina A2 constituye el 2-3%,
mientras que la hemoglobina F, predominante en
el feto, constituye el 1%.
Las
hemoglobinas Gower I, Gower II y Portland solo
están presentes durante la etapa embrionaria.
Los genes que
codifican las cadenas de globina están presentes en
el cromosoma 11 y en el cromosoma
16. Estos genes se reordenan en el mismo orden en el que se
expresan. El cambio de síntesis de una globina a otra está relacionado con la
metilación de los genes. Cuanto menos metilados estén más se expresan.
Funciones de la hemoglobina: La principal
función de la hemoglobina es la de transportar oxígeno desde los pulmones a los
tejidos. Pero también contribuye al transporte de CO2 en sentido contrario, desde los tejidos a los
pulmones. De este modo la hemoglobina cumple su función de vehículo en
el transporte e intercambio gaseoso, que ocurre tanto en pulmones como en
tejidos.
Como
hemos visto anteriormente, la unión del O2 al ión
ferroso Fe2+ es reversible. Además, cada
molécula de hemoglobina puede fijar un máximo de cuatro moléculas de oxígeno,
es decir, tantas moléculas de oxígeno como grupos hemo se encuentran en ella. Otra
función que lleva a cabo la hemoglobina es la de regulación del pH.
Grado de saturación de la
hemoglobina: Se denomina grado de saturación de la hemoglobina al porcentaje de hemoglobina con oxígeno (oxihemoglobina)
respecto al total de la hemoglobina.
La
saturación de la hemoglobina depende de la concentración de O2 y de su afinidad por él. Su concentración se
expresa como presión parcial de oxígeno bajo las siglas PO2.
La
representación gráfica del grado de saturación con respecto a la concentración
de oxígeno recibe el nombre de curva de disociación de la hemoglobina.
En la gráfica, el P50 representa
la presión parcial de oxígeno a la cual la hemoglobina está saturada al 50%.
La
curva de disociación se desplaza a izquierda o a derecha en función de la
afinidad por el oxígeno. Esa afinidad viene determinada precisamente por
la P50,
y se puede ver alterada por los siguientes factores:
- Un aumento de concentración de CO2 en el
medio disminuye la afinidad.
- El 2,3 difosfoglicerato disminuye
la afinidad de la hemoglobina por el O2. Esto
favorece su liberación a los tejidos.
- El pH modifica
la afinidad. Si desciende (aumenta la acidez, con un aumento de la
concentración de hidrogeniones) la afinidad disminuye. El O2 se libera de la hemoglobina para unirse a
los H+ y neutralizar el pH. A esta propiedad se
le denomina efecto Bohr.
Estos
tres factores, o propiedades, disminuyen la afinidad y la liberación de O2 en los tejidos. En cambio, aumentan la
afinidad por el oxígeno durante el intercambio gaseoso que ocurre en los
alveolos pulmonares. Es decir, tienen un efecto u otro en función de la
localización.
La elevación de la temperatura (fiebre) también
disminuye la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno, ya que existe un
aumento del metabolismo celular.
Otros tipos de hemoglobina: Hasta el momento hemos visto las hemoglobinas normales. Existen
hemoglobinas patológicas como la C y la S que veremos en el futuro. Y también
encontramos hemoglobinas que pueden saturarse por moléculas diferentes al O2. En función de lo que se unan al grupo protéico
recibirán una denominación u otra:
- Oxihemoglobina: Es la consideraba normal, saturada de
oxígeno.
- Deoxihemoglobina: También denominada hemoglobina reducida. Los cuatro grupos hemo se
encuentran sin oxígeno.
- Carbaminohemoglobina: La fracción protéica está saturada de
CO2. Se forma tras el intercambio gaseoso que
ocurre a nivel celular en los tejidos.
- Metahemoglobina: El hierro del grupo hemo se encuentra
oxidado (ión férrico F3+). No fija
el oxígeno.
- Carboxihemoglobina: El grupo protéico está saturado por
monóxido de carbono (CO), que tiene una afinidad muy superior a la del
oxígeno. Puede ser mortal, ya que no tiene función respiratoria y produce
asfixia tisular. Esta desoxigenación tiene una característica contraria al
resto de fallecimientos por asfixia, ya que los fallecidos no presentan
cianosis, al contrario, presentan un color de piel rojo cereza.
- Sulfohemoglobina: El grupo protéico presenta la unión de
un radical sulfuro (S-2). Tampoco
tiene función respiratoria.
- Hemoglobina glucosilada: Está presente de forma normal en
sangre en bajas proporciones. Pero se ve aumentada en patologías como la
diabetes. El grupo protéico se une a la glucosa y a otros hidratos de
carbono libres.
- Cianhemoglobina: El O2 es
sustituído por el radical cianuro (CN–). No tiene
función respiratoria.
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