Fecha límite de entrega: 17/julio/2020.-
A) Preguntas a responder:
- a)¿Cómo representarías mediante una ecuación química la reacción de fermentación alcohólica? b)¿Qué otros tipos de fermentación conoces?
- c)¿En qué condiciones se produce la fermentación alcohólica en un organismo como la levadura saccharomyces cereviceae?
- a)¿Qué son los grados Brix?b) ¿Qué aparato de Laboratorio informa en grados Brix? c)¿Qué fundamenta la medición? d) ¿En qué otras muestras se usa dicha técnica?
- ¿Qué son los azúcares reductores?
- ¿A qué se le llama patrón en un TP de laboratorio?
- ¿Qué es una calibración en un TP de laboratorio?
- ¿Qué es un Blanco en un TP de laboratorio?
- ¿A qué se denomina curva de calibración y para qué se realiza en un TP de laboratorio?
- En la tabla 2 se muestran los resultados obtenidos:¿Qué significa que los grados Brix hayan disminuído con el tiempo?
Obtención de etanol por fermentación alcohólica de licor obtenido de residuos lignocelulósicos
Fundamentación:
La lignocelulosa (hemicelulosa y lignina)
es
el
principal
y
más
abundante componente de la biomasa
producida por la fotosíntesis. La pared celular de las plantas está formada por
lignocelulosa, la composición y porcentajes
de los polímeros
varían entre
las especies de plantas, incluso
entre la edad y la etapa de crecimiento. Los azúcares
obtenidos de la
biomasa celulósica pueden ser utilizados
en
la
producción de bioetanol. La producción de etanol a partir de celulosa
se
logra
a
través
de
la
degradación de ésta para obtener celooligosacáridos y glucosa,
seguido
de
la
conversión de la glucosa a etanol por diferentes microorganismos como levaduras
y bacterias.
La levadura Saccharomyces cerevisiae es un
huésped atractivo para la producción de proteínas
recombinantes de importancia médica y alimenticia,
debido
a
que
es
un
organismo
no
patógeno libre de endotoxinas para el hombre y su utilización a escala industrial
se
remonta
hace
siglos. Presenta como ventajas su fácil manejo y alta velocidad de crecimiento en comparación
con las bacterias en condiciones anaerobias,
posee una organización subcelular eucarionte
capaz
de
realizar los procesos postraduccionales
de
proteínas complejas.
La producción
de
etanol
a
partir del material celulósico ha sido motivo de numerosas investigaciones y se ha utilizado
a S. cerevisiae para expresar genes de celulasas con la finalidad de sacarificar
y
fermentar
simultáneamente. (Cuervo & Cols, 2009).
Objetivo: El objetivo de esta práctica es la
producción de etanol mediante la utilización de Saccharomyces cerevisiae a partir
de un compuesto lignocelulósico, a partir de la
cáscara de naranja.
Materiales:
preparación
de 1 litro de ácido sulfúrico al 2%.
50
ml de hidróxido de Sodio al 40%,
50
ml de una solución patrón de glucosa al 0.4% y 250 ml de ácido
dinitrosalicílico (DNS) al 1%.
Para
la preparación de las soluciones de H₂SO₄,
NaOH y la solución patrón de glucosa se utilizó la
fórmula: preparación de
1 litro de ácido sulfúrico al 2%.
50 ml de hidróxido de Sodio al 40%,
50 ml de una
solución patrón de glucosa al 0.4% y
250 ml de ácido dinitrosalicílico (DNS) al
1%
Preparación del reactivo DNS se disolvieron
en 50 ml de agua destilada las siguientes soluciones en orden:
1.4 g de NaOH, 21.6 g metabisulfito de sodio y 0.75
g de ácido 3-5 dinitrosalicílico. Finalmente se aforó a 100 ml con agua
destilada.
Activación del inoculo.
Para la activación delinoculo se utilizaron 11 g de saccharomyces cerevisiae comercial en polvo y se vertieron en 50 ml de
agua tibia durante 10 minutos. (Se trabajó en condiciones asépticas y todos los materiales
y medios se
encontraban esterilizados).
50g
(variable) del residuo (cáscara de naranja) en un matraz Erlenmeyer de 1 litro.
Se agregaron 500 ml de una solución de H₂SO₄.
Se esterilizó a 121°C durante
15 minutos. Posteriormente se dejó reposar
durante 20 minutos.
Fermentación alcohólica del licor. Se midieron 300 ml del licor en un matraz Erlenmeyer
de 500ml y se ajustó su pH entre 4.5 y 5.5 con NaOH al 40%. Se adicionaron
los 50 ml del inoculo de Saccharomyces
cerevisiae activado. Después se selló el
matraz con un tapón para mantener las condiciones
anaerobias y se incubó el matraz a 30°C durante 48 horas. Se llevó a cabo un monitoreo del proceso de
fermentación mediante la medición de pH, azúcares reductores y grados Brix a
las 0, 4, 16, 24 y 48 horas. Finalizada la fermentación, se filtra con tela de lino p gasas superpuestas y posteriormente
en un embudo Büchner con papel Whatman No.1 para eliminar la biomasa.
Medición de pH. Se realizó la medición de pH mediante el uso de un potenciómetro previamente
calibrado con soluciones buffer de pH 10 y pH 4.
Determinación de grados Brix.
Se hizo uso de un refractómetro manual el cual se calibró previamente
a 0 con agua destilada y a 10 con una solución de sacarosa al 10%. Se colocó
una gota de la muestra y se realizó la lectura.
Determinación de azúcares reductores.
Se tomaron por duplicado muestras de 0.5 ml a las 0. 4. 16. 24 y 48 h. El resto
del método se llevó a cabo en la sesión 2 y será explicado más adelante
Sesión
2
Calibración con solución patrón de glucosa:
se prepararon tubos de reacción como
se prepararon tubos de reacción como
se muestra en la tabla siguiente:
TUBO
|
Concentración de Glucosa en
g/l
|
ml de patrón de glucosa
|
ml de agua destilada
|
BLANCO
|
0,0
|
0,000
|
0,500
|
1
|
0,2
|
0,025
|
0,475
|
2
|
0,4
|
0,050
|
0,450
|
3
|
0,6
|
0,075
|
0,425
|
4
|
0,8
|
0,100
|
0,400
|
5
|
1,0
|
0,125
|
0,375
|
6
|
1,2
|
0,150
|
0,350
|
Tabla
1. Preparación de tubos de reacción para la curva de calibración.
Se adicionaron
0.5 ml del reactivo DNS al 1% a cada tubo (incluyendo las muestras de 0.5 ml que se tomaron por duplicado). Después se agitaron todos los tubos en un vórtex y se pusieron a
ebullición durante 5 minutos en baño María. Después se dejaron reposar 15
minutos a temperatura ambiente y se leyó su absorbancia a 540 nm en un
espectrofotómetro UV-VIS.
El
filtrado final del producto de la fermentación se destiló a ebullición y se recolectaron por separado tres fracciones de 10 ml.
Además,
se prepararon soluciones al 0. 10, 20, 30, 40, 50 y 60% de etanol al 96% en
tubos de ensayo
con
tapón. Se determinó el
índice de refracción de cada solución y las tres fracciones destiladas
del producto final de la fermentación alcohólica. Para la cuantificación del
contenido de
alcohol
el
índice
e refracción obtenido se correlacionó con los porcentajes de
alcohol.
Monitoreo
del proceso de fermentación.
Hora
|
PH
|
°Brix
|
Azúcares reductores
|
0
|
4,73
|
8,4
|
0, 382
|
4
|
4,8
|
7,3
|
0,398
|
16
|
4,51
|
6,0
|
0,402
|
24
|
4,50
|
5,4
|
0,402
|
48
|
4,40
|
5,2
|
0,441
|
Tabla
2. Resultados obtenidos durante la medición de los parámetros del proceso de
fermentación s Brix reflejan la cantidad de azúcar disuelta
en un líquido.