T.P.N°7- Metabolismo Celular

Fecha límite de entrega: 17/julio/2020.-

A) Preguntas a responder:

1. a)¿Cómo representarías mediante una ecuación química la reacción de fermentación alcohólica? b)¿Qué otros tipos de fermentación conoces?

1. c)¿En qué condiciones se produce la fermentación alcohólica en un organismo como la levadura saccharomyces cereviceae?
2. a)¿Qué son los grados Brix?b) ¿Qué aparato de Laboratorio informa en grados Brix? c)¿Qué fundamenta la medición? d) ¿En qué otras muestras se usa dicha técnica?
3. ¿Qué son los azúcares reductores?
4. ¿A qué se le llama patrón en un TP de laboratorio?
5.  ¿Qué es una calibración en un TP de laboratorio?
6. ¿Qué es un Blanco en un TP de laboratorio?
7. ¿A qué se denomina curva de calibración y para qué se realiza en un TP de laboratorio?
8. En la tabla 2 se muestran los resultados obtenidos:¿Qué significa que los grados Brix hayan disminuído con el tiempo? 

 B) Análisis del Trabajo práctico de laboratorio:

Obtención de etanol por fermentación alcohólica de licor obtenido de residuos lignocelulósicos

Fundamentación: La lignocelulosa (hemicelulosa   y   lignina)   es   el   principal   y   más abundante componente  de   la   biomasa producida por la fotosíntesis. La pared celular de las plantas está formada por lignocelulosa, la composición y porcentajes   de   los   polímeros   varían   entre   las especies de plantas, incluso entre la edad y la etapa de   crecimiento.   Los   azúcares   obtenidos   de   la biomasa   celulósica   pueden   ser   utilizados   en   la producción de bioetanol. La producción de etanol a partir   de   celulosa   se   logra   a   través   de   la degradación   de   ésta   para   obtener celooligosacáridos   y   glucosa,   seguido   de   la conversión de la glucosa a etanol por diferentes microorganismos como levaduras y bacterias.

La levadura Saccharomyces cerevisiae es un huésped atractivo   para   la   producción   de   proteínas recombinantes   de   importancia   médica   y alimenticia,   debido   a   que   es   un   organismo   no patógeno libre de endotoxinas para el hombre y su utilización   a   escala   industrial   se   remonta   hace siglos. Presenta como ventajas su fácil manejo y  alta velocidad de crecimiento en comparación con las bacterias en condiciones anaerobias, posee una organización   subcelular   eucarionte   capaz   de realizar   los   procesos   postraduccionales   de proteínas   complejas.

 La   producción   de   etanol   a partir  del material celulósico  ha sido  motivo  de numerosas investigaciones y se ha utilizado a S. cerevisiae para expresar genes de celulasas con la finalidad   de   sacarificar   y   fermentar simultáneamente. (Cuervo & Cols, 2009).

  

Objetivo: El objetivo de esta práctica es la producción de etanol mediante la utilización de  Saccharomyces cerevisiae    a   partir   de   un   compuesto lignocelulósico, a partir de la cáscara de naranja.

Materiales:

preparación de 1 litro de ácido sulfúrico al 2%.

50 ml de hidróxido de Sodio al 40%,

50 ml de una solución patrón de glucosa al 0.4% y 250 ml de ácido dinitrosalicílico (DNS) al 1%.

Para la preparación de las soluciones de H₂SO₄, NaOH y la solución patrón de glucosa se utilizó la fórmula: preparación de 1 litro de ácido sulfúrico al 2%.

50 ml de hidróxido de Sodio al 40%, 

50 ml de una solución patrón de glucosa al 0.4% y 

250 ml de ácido dinitrosalicílico (DNS) al 1%

Preparación   del   reactivo   DNS   se disolvieron  en   50   ml   de  agua   destilada   las siguientes   soluciones   en   orden:   1.4   g   de NaOH, 21.6 g metabisulfito de sodio  y  0.75 g de ácido 3-5 dinitrosalicílico. Finalmente se aforó a 100 ml con agua destilada.

Activación del inoculo. Para la activación delinoculo se utilizaron 11 g de saccharomyces cerevisiae  comercial en polvo y se vertieron en 50 ml de agua tibia durante 10 minutos. (Se trabajó en condiciones asépticas y todos los   materiales   y   medios   se   encontraban esterilizados).

50g (variable) del residuo (cáscara de naranja) en un matraz Erlenmeyer de   1   litro.   

Se   agregaron   500   ml   de   una solución   de   H₂SO₄.  

Se   esterilizó   a   121°C durante 15   minutos.   Posteriormente   se   dejó reposar durante 20 minutos.

Fermentación   alcohólica   del   licor.  Se midieron   300   ml   del   licor   en   un   matraz Erlenmeyer de 500ml y se ajustó su pH entre 4.5 y 5.5 con NaOH al 40%. Se adicionaron los 50 ml del inoculo de Saccharomyces   cerevisiae  activado. Después se selló el matraz con   un   tapón   para   mantener   las   condiciones anaerobias y se incubó el matraz a 30°C durante 48   horas.   Se   llevó   a   cabo   un   monitoreo   del proceso de fermentación mediante la medición de pH, azúcares reductores y grados Brix a las 0, 4, 16, 24 y 48 horas. Finalizada la fermentación, se filtra   con   tela   de   lino   p   gasas   superpuestas   y posteriormente en un embudo Büchner con papel Whatman No.1 para eliminar la biomasa.

Medición  de  pH. Se realizó   la  medición  de  pH mediante el uso de un potenciómetro previamente calibrado con soluciones buffer de pH 10 y pH 4.

Determinación de grados Brix. Se hizo uso de un refractómetro   manual   el   cual   se   calibró previamente a 0 con agua destilada y a 10 con una solución de sacarosa al 10%. Se colocó una gota de la muestra y se realizó la lectura.

Determinación de azúcares reductores. Se tomaron por duplicado muestras de 0.5 ml a las 0. 4. 16. 24 y 48 h. El resto del método se llevó a cabo en la sesión 2 y será explicado más adelante

Sesión 2

 Calibración con solución patrón de glucosa: 




se prepararon  tubos de reacción como 

se muestra  en la tabla siguiente:

TUBO	Concentración de Glucosa en g/l	ml de patrón de glucosa	ml de agua destilada
BLANCO	0,0	0,000	0,500
1	0,2	0,025	0,475
2	0,4	0,050	0,450
3	0,6	0,075	0,425
4	0,8	0,100	0,400
5	1,0	0,125	0,375
6	1,2	0,150	0,350

Tabla 1. Preparación de tubos de reacción para la curva de calibración.

Se adicionaron 0.5 ml del reactivo DNS al 1% a cada tubo (incluyendo las muestras de 0.5 ml que   se   tomaron   por   duplicado).   Después   se agitaron   todos   los   tubos   en   un   vórtex   y   se pusieron a ebullición durante 5 minutos en baño María. Después se dejaron reposar 15 minutos a temperatura ambiente y se leyó su absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro UV-VIS.

El filtrado final del producto de la fermentación se   destiló  a   ebullición   y   se   recolectaron   por separado tres fracciones de 10 ml.

Además, se prepararon soluciones al 0. 10, 20, 30, 40, 50 y 60% de etanol al 96% en tubos de ensayo  con tapón.  Se  determinó  el índice de refracción de cada solución y las tres fracciones destiladas del producto final de la fermentación alcohólica. Para la cuantificación del contenido de  alcohol  el  índice e refracción obtenido  se correlacionó con los porcentajes de alcohol.

Monitoreo del proceso de fermentación.

Hora	PH	°Brix	Azúcares reductores
0	4,73	8,4	0, 382
4	4,8	7,3	0,398
16	4,51	6,0	0,402
24	4,50	5,4	0,402
48	4,40	5,2	0,441

Tabla 2. Resultados obtenidos durante la medición de los parámetros del proceso de fermentación s   Brix   reflejan   la   cantidad   de   azúcar disuelta en un líquido.