OBJETIVO:
Cuantificar azúcares presentes en distintas soluciones problema, aplicando técnicas
ópticas.
a) Espectrofotometría de absorción molecular
b) Refractometría
FUNDAMENTOS:
En general, los carbohidratos constituyen la mayor
parte de los componentes vegetales. Son
carbohidratos los diferentes azúcares, almidones, celulosa, hemicelulosas,
pectinas y numerosas gomas.
Los
azúcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en el
jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en
forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacáridos que
conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Tradicionalmente las frutas se han valorado
por su atractiva apariencia, textura, valor nutritivo y fundamentalmente por su
sabor. En todos estos atributos de
calidad los carbohidratos desempeñan un papel relevante, por ejemplo, el sabor
está dado básicamente por un balance entre azúcares y ácidos orgánicos. El sabor característico de y diferente de las
frutas se debe a la gran variación en composición y concentración de los
azúcares; el color atractivo se debe principalmente a los glucósidos
(antocianinas y antoxantinas) y la firmeza está determinada por los
polisacáridos estructurales.
Es
importante señalar que las proporciones de los diversos carbohidratos
existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia
de la actividad metabólica, ya que durante la maduración se producen cambios
intensos en donde los azúcares son los sustratos preferidos para la biosíntesis
y suministro de energía pues son oxidados (vía glucólisis) hasta ácido
pirúvico, el cual a su vez, por descarboxilación oxidativa se convierte en
Acetil-CoA que se metaboliza, vía ciclo de Krebs, dando lugar a la formación de
CO2, H2O y ENERGÍA la cual queda disponible para la
biosíntesis de otros componentes (otros azúcares, ácidos orgánicos, ácido
ascórbico, proteínas, nucleótidos azucarados, glucósidos, etc.). Durante todo este proceso, el contenido de
azúcares aumenta casi invariablemente básicamente por hidrólisis que
experimentan los polisacáridos, aunque algunos azúcares sean utilizados como
sustratos para la actividad respiratoria.
Dada
la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios métodos para su
determinación: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc.,
pero todos ellos se basan en el mismo principio:
Todos
los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como
azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles (reductonas) al
calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y
se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes, por lo
tanto, los azúcares en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes
como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63-
y los azúcares se oxidan formando mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la que se utiliza
tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.
Una
de las técnicas analíticas más potentes consiste en determinar la cantidad de
una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiación absorbida por la
misma. Esta técnica se llama
Espectrofotometría. Se puede utilizar el
espectrofotómetro para determinar la longitud de onda de la radiación necesaria
para las determinaciones de la cantidad de azúcar en las muestras bajo
estudio, comparándola después con la
radiación absorbida por un blanco. La
regla específica que relaciona la cantidad de radiación absorbida por una
substancia con la concentración de esa misma substancia se llama Ley de Beer y
se puede establecer como sigue:
Log Io = abc
I
En donde:
Io = Radiaciòn incidente o radiaciòn transmitida por
el blanco.
I = Radiaciòn
transmitida por la muestra.
Log Io
= absorbancia de la muestra
I
En
donde:
a = coeficiente de absorbancia (absortividad) – las
unidades dependen de las unidades utilizadas para la determinaciòn de la
concentraciòn.
b = longitud de la celda usualmente en centìmetros.
c =
concentraciòn de la muestra en las unidades apropiadas.
I
En
esta práctica se empleará la técnica colorimétrica de Nelson y Ting para
determinar glucosa, fructosa y sacarosa.
MATERIAL
6 matraces volumétricos de 100 ml con tapón.
2
matraces volumétricos de 500 ml con tapón.
2
matraces volumétricos de 250 ml con tapón.
1
embudo de vidrio.
2
matraces Erlenmeyer de 125 ml.
6
pipetas de 10 ml.
2
pipetas de 1 ml.
2
pipetas de 5 ml.
2
vasos de precipitados de 250 ml.
1
baño María simple.
5
celdas de espectrofotómetro.
1
gradilla.
2
círculos de 10 cm de diámetro de papel filtro Whatman # 1.
Papel
sanitario blanco (proporcionado por el estudiante).
Algodón
o gasa .
1
cuchillo de cocina (proporcionado por el estudiante).
1
tabla para cortar la fruta (proporcionada por el estudiante).
Fruta: 3
ejemplares por especie por equipo. En el
caso del melón con 1 ejemplar basta (proporcionados por el estudiante).
EQUIPO:
1 extractor
de jugos.
1
licuadora o mortero.
1
potenciómetro.
1
baño María con control de temperatura y agitación.
1
espectrofotómetro Spectronic 20'® a 515 nm.
REACTIVOS
Solución
alcalina de Ferricianuro.
Solución
de Arsenomolibdato (25 g).
H2SO4
2N.
NaOH
10N, 1N y 0.1N.
HCl
1:1 (Vol/Vol).
Na2CO3
anhidro. (12.5 g) ó
Na2CO3
monohidratado. (14.3 g).
Tartrato
de potasio (12.3 g).
NaHCO3
(10 g).
Na2SO4
anhidro disuelto en 35º ml de agua destilada.
CuSO4
· 5H2O disuelto en 50 ml. de H2O.
Glucosa
(300 µg/ml).
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Reactivo
de Nelson A.- Disuelva 12.5 g Na2CO3
anhidro (ó 14.3 g Na2CO3 · H2O), 12.3 g de
tartrato de potasio, 10 g de NaHCO3 y 100 g de Na2SO4
anhidro en 350 ml de H2O y afore a 500 ml.
Reactivo
de Nelson B.- Disuelva 7.5 g de
CuSO4 · 5H2O en 50 ml. de H2O y añada una gota
de H2SO4.
Reactivo
Alcalino de Nelson.- Mezcle 25
ml del reactivo de Nelson A + 1.0 ml. del reactivo de Nelson B.
Curva
de la Glucosa.- Elaborar una
solución stock de glucosa en agua que contenga 300 µg/ml. Preparar una serie de diluciones desde 300
hasta 30 µg/ml.
Reactivo
de Arsenomolibdato.- Disuelva 25
g de (NH4)6Mo7O24
· 4H2O (molibdato de amonio tetrahidratado) en 450 ml. de agua
destilada.
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE AZÚCARES
REDUCTORES TOTALES
Prepare una serie de diluciones a partir
de la solución stock de glucosa. Las
concentraciones deberán ser de 300, 150, 75 y 30 µg/ml. Utilice matraces volumétricos aforados con
tapón y márquelos con la concentración correspondiente.
1.
Pipetee
1 ml. de cada solución estándar de glucosa y agua destilada como blanco en tubos de ensayo con capacidad de 25 ml.
aforados.
2.
Añada
1 ml. de reactivo alcalino de Nelson.
3.
Mezcle. Colóque los tubos en un baño de agua hirviendo
durante 20 minutos y enfríelos al chorro de agua fría.
4.
Añada
1 ml. de arsenomolibdato.
5.
Mezcle
bien por un períodode 5 min. (para disolver el Cu2O para reducir el
aresnomolibdato).
6.
Afore
a 25 ml. con agua destilada y mezcle.
7.
Lea
la absorbancia a 520 nm.
Grafíque la absorbancia contra la concentración
(µg/g). Utilice esta curva estándar para
determinar la concentración de glucosa en las muestras de frutas.
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA LA
DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES
1.- Extraiga el
jugo de la fruta asignada mediante un extractor de jugos.
2.- Diluya el
jugo de la muestra con agua destilada (1:49).
3.- Coloque 5
ml. del jugo diluido en un matraz volumétrico de 250 ml. y afore con agua
destilada.
DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES
1.- Transfiera
1 ml. del jugo diluido a un matraz volumétrico aforado de 100ml. y añada 5 ml. de reactivo de
ferricianuro.
2.- Colóque los
matraces en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.
3.- Enfríe los
matraces inmediatamente bajo el chorro de agua fría.
4.- Neutralice
el contenido de los matraces con 10 ml.
de solución de ácido sulfúrico 2N.
5.- Mezcle los contenidos de los matraces suavemente
hasta que no emanen más gases.
6.- Añada 4 ml.
de arsenomolibdato.
7.- Mezcle una
vez más el contenido de los matraces.
8.- Afore a 100
ml. con agua destilada.
9.- Tome una
celda del espectrofotómetro y transfiera ahí el contenido de cada matraz (uno
por celda).
10.- Efectúe la lectura en el espectrofotómetro a 520
nm. El blanco constará de todos los
reactivos antes mencionados, excepto la muestra de jugo de fruta bajo
estudio. No olvide ajustar el
espectrofotómetro con agua destilada al principio.
CÁLCULOS:
A
partir de la curva estándar se calcula el valor k para la determinación de
azúcares reductores totales mediante la siguiente fórmula:
k
= c/a
En
donde:
k = El factor por unidad de absorbancia o
pendiente de la curva.
c = Concentración de azúcares reductores en
gramos/100 ml.
a =
Absorbancia de la solución a esa concentración.
Los
valores k a diferentes concentraciones de azúcar se promedian y se designan
como K. El contenido total de azúcares
reductores, S, de la muestra se calcula de la fórmula:
S = K.A.D.
En donde:
S =
Concentración total de azúcares reductores de la muestra en gramos/100 ml de
jugo.
K =
Pendiente promedio de la curva.
D =
Factor de dilución.
DETERMINACIÓN DE FRUCTOSA
Al calentar una mezcla de glucosa y fructosa a cierta temperatura - eg., 55°C - con el reactivo alcalino de ferricianuro, la velocidad de oxidación de la glucosa es considerablemente menor que la de fructosa. El resultado obtenido es conocido como fructosa aparente. Ésta es ligeramente más alta que el contenido real de fructosa en la muestra, la cual puede ser calculada usando las fórmulas adecuadas. El procedimiento para la determinación de esta fructosa aparente es el mismo que para el cálculo de los azúcares reductores totales, excepto que se cambia la temperatura y el período de calentamiento a 55°C por 30 minutos.
Los
valores de Kf y Kg de
fructosa y glucosa respectivamente, oxidados a 55°C se obtienen a partir de las
curvas estándar de estos dos azúcares, de la forma descrita para K. La proporción de Kg a Kf ó Q se utiliza para el cálculo real de
glucosa y fructosa de la muestra con las siguientes ecuaciones simultáneas:
G + F = S G/Q + F = L
En donde:
G =
Porcentaje de glucosa en la muestra.
F = Porcentaje de fructosa en la muestra.
S = Porcentaje de azúcares reductores totales
(Suma de G y F).
L = Porcentaje aparente de fructosa.
Q = Proporción entre Kg y Kf (Kg/Kf)
En
una mezcla de glucosa y fructosa se asume que ambos azúcares presentes son
fructosa. La fructosa aparente L se
calcula a partir de la fórmula S = K.A.D., sustituyendo L por S y Kf
por K. Se obtiene la siguiente fórmula
para el porcentaje de glucosa en la muestra:
G = (S - L) X Q
Q-1
El
cociente q/(Q-1), se utiliza como una constante en los cálculos del valor real
de la glucosa. El valor real de la
fructosa se obtiene por diferencia.
DETERMINACIÓN
DE AZÚCARES TOTALES Y SACAROSA
La
sacarosa de la muestra es invertida con el ácido clorhídrico. El procedimiento se describe a continuación:
1.- Se colocan 50ml. del jugo diluido en un vaso de
precipitados de 150 ml. y se añaden 10 ml. de ácido clorhídrico (1:1).
2.- Se deja
reposar esta mezcla durante 18 horas a temperatura ambiental.
3.- Se añaden 5
ml. de solución de hidróxido de sodio 10N y los contenidos se ajustan a un pH
de entre 5 y 7 con una solución de hidróxido de sodio 1N mediante el uso de un
potenciómetro.
4.- Los
contenidos se transfieren a un matraz volumétrico aforado de 100ml y se afora
con agua destilada.
5.- Se toma una
alícuota de 1 ml de esta solución y se pipetea en un matraz volumétrico de 100
ml. y se sigue el procedimiento descrito
para la determinación de azúcares reductores totales.
6.- Se calcula la cantidad de sacarosa de la
diferencia entre el contenido de azúcares reductores antes y después de la inversión, multiplicada
por el factor de 0.95.
Elabore
un reporte comparando los diversos valores obtenidos para cada especie de futas
estudiadas en la sesión de laboratorio.
CUESTIONARIO- Entrega fecha: 9 de octubre del 2020.-
1.- ¿Qué grupos funcionales presentan los azúcares?
2- ¿Qué es un azúcar reductor?
3-¿Por qué la
sacarosa no se considera como un azúcar reductor?
4- ¿Para qué
se utiliza el cobre en el reactivo de Nelson?
5- ¿Qué es un ensayo cuantitativo?¿Qué dato me aporta?
6- Haz un breve resumen de las técnicas cuantitativas seleccionadas:
Espectrofotometría de absorción molecular
b) Refractometría
7_7- ¿Se usan testigos en estas técnicas cuantitativas?¿Se usa curva de calibrado?
8_ 8-¿Cómo se logra cuantificar fructosa en presencia de otros azúcares reductores?
8
8
BIBLIOGRAFIA:
A.O.A.C. Official Methods of Analysis.
1980. Horwitz W. (ed). Ed. 13th.
Washington, U.S.A.
Ting, S.V. 1956.
Rapid Colorimetric Methods for Simultaneous Determination of Total
Reducing Sugars and Fructose in Citrus Juices. Agric. Food Chem. Vol. 4(3) 263-266.
