Repaso teórico
Refresquemos algunas diferencias
Trabajo
Práctico Nº 10
Tema:
tecnología del ADN
FUNDAMENTO
El ADN
recombinante, o ADN recombinado, es una molécula de ADN artificial
formada de manera deliberada in vitro por la unión
de secuencias de ADN provenientes de dos organismos distintos que normalmente
no se encuentran juntos. Al introducirse este ADN recombinante en un organismo,
se produce una modificación genética que permite la adición de una nueva secuencia de ADN al
organismo, conllevando a la modificación de rasgos existentes o la expresión de
nuevos rasgos. La producción de una proteínano presente en un organismo
determinado y producidas a partir de ADN recombinante, se llaman proteínas
recombinantes.
El ADN
recombinante es resultado del uso de diversas técnicas que los biólogos moleculares utilizan para manipular las moléculas de ADN y difiere de
la recombinación genética que ocurre sin intervención dentro de la célula. El proceso consiste en tomar una molécula
de ADN de un organismo, sea virus, planta o una bacteria y en el
laboratorio manipularla y ponerla de nuevo dentro de otro organismo. Esto se
puede hacer para estudiar la expresión de un gen, para producir proteínas en el tratamiento de una enfermedad genética, vacunas o con fines económicos y científicos.
El proceso de producción de un ADN recombinante comienza con
la identificación desde un organismo de una secuencia de ADN de interés con el
fin de propagarlo en otro organismo que carece de
la secuencia y, por ende, del producto proteico de esa secuencia de ADN. Así se pueden producir cantidades
ilimitadas de la proteína codificada por el susodicho gen. En términos
simples, el procedimiento consiste en:
·
Localización
de genes y sus funciones.
·
Clonación
del ADN, y su posterior almacenamiento en genes.
Una técnica utilizada para amplificar, o hacer
muchas copias de, una región de ADN blanco en específico. Puntos más importantes:
·
La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una
técnica para hacer muchas copias de una determinada región de ADN in vitro (en
un tubo de ensayo en lugar de un organismo).
·
La PCR depende de una ADN polimerasa termoestable, la Taq polimerasa,
y requiere de cebadores de ADN diseñados específicamente
para la región de ADN de interés.
·
En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de
cambios de temperatura que permiten la producción de muchas copias de la región
blanco.
·
La PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la
práctica. Se utiliza de forma rutinaria en la clonación de ADN, el diagnóstico
médico y el análisis forense de ADN.
¿Qué es la PCR?
La reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) es una técnica de
laboratorio común utilizada para hacer muchas copias (¡millones o miles de
millones!) de una región particular de ADN. Esta región de ADN puede ser
cualquier cosa que le interese al experimentador. Por ejemplo, podría ser un
gen cuya función quiere entender un investigador o un marcador genético usado
por científicos forenses para relacionar el ADN de la escena del crimen con los
sospechosos.
Por lo general, el objetivo de la
PCR es producir suficiente ADN de la región blanco para que pueda analizarse o
usarse de alguna otra manera. Por ejemplo, el ADN amplificado por PCR se
puede secuenciar, visualizar por electroforesis
en gel o clonar en un plásmido para otros experimentos.
La PCR se utiliza en muchas áreas
de la biología y la medicina, como la investigación en biología molecular, el
diagnóstico médico e incluso algunas ramas de la ecología.
La Taq polimerasa
Al igual que la replicación
de ADN en un
organismo, la PCR requiere de una enzima ADN polimerasa que produzca nuevas
cadenas de ADN mediante el uso de las cadenas existentes como molde. La ADN
polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa,
por la bacteria tolerante al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus).
T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales.
Su ADN polimerasa es muy termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de
los 70°C (temperatura
a la que la ADN polimerasa de ser humano o de E. coli no
funcionaría). La Taq polimerasa es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad
térmica. Como veremos, la PCR utiliza altas temperaturas repetidamente
para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus
cadenas.
Cebadores para PCR
Al igual que otras ADN
polimerasas, la Taq polimerasa solo puede hacer ADN si hay
un cebador, una corta secuencia de nucleótidos que
proporciona un punto de partida para la síntesis de ADN. En una reacción de
PCR, la región de ADN que será copiada, o amplificada, se determina por los
cebadores que el o la investigadora elija.
Los cebadores para PCR son
pedazos cortos de ADN de cadena sencilla, generalmente de unos 202020 nucleótidos
de longitud. En cada reacción de PCR se utilizan dos cebadores que están
diseñados para flanquear la región blanco (la región que debe ser copiada). Es
decir, les agregan secuencias que harán que se unan a cadenas opuestas del
molde de ADN solo en los extremos de la región a copiar. Los cebadores se unen
al molde mediante complementariedad de bases.
Los pasos de la PCR
Los ingredientes clave para una
reacción de PCR son Taq polimerasa, cebadores,
ADN molde y nucleótidos (los bloques básicos del ADN). Los ingredientes se
colocan en un tubo, junto con los cofactores que necesite la enzima, y se
someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento que permiten la
síntesis del ADN.
Los pasos básicos son:
1. Desnaturalización (96°C): la reacción
se calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto
proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso.
2. Templado (555555 - 656565°C): la reacción se enfría para que los cebadores puedan unirse a
sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.
3. Extensión (72°C): la temperatura de la reacción se eleva para que
la Taqpolimerasa
extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN.
Este ciclo se repite 252525 - 353535 veces en una reacción de PCR típica, que
generalmente tarda 222 - 444 horas,
según la longitud de la región de ADN que se copia. Si la reacción es eficiente
(funciona bien), puede producir miles de millones de copias a partir de una o
unas cuantas copias de la región blanco.
Eso es porque no solo se usa el ADN
original como molde en cada ciclo. En realidad, el nuevo ADN que se produce en
una ronda puede servir como molde en la siguiente ronda de síntesis de ADN. Hay
muchas copias de los cebadores y muchas moléculas de Taq polimerasa
flotando en la reacción, por lo que el número de moléculas de ADN casi puede
duplicarse en cada ciclo. La siguiente imagen muestra este patrón de
crecimiento exponencial.
Uso de la electroforesis en gel para visualizar los resultados
de una PCR
Habitualmente,
los resultados de una reacción de PCR se visualizan (se hacen visibles) al
usar electroforesis en gel. La electroforesis en gel es
una técnica en la que una corriente eléctrica impulsa fragmentos de ADN a
través de una matriz de gel y los fragmentos de ADN se separan según su tamaño.
Típicamente se incluye un estándar, o marcador de peso molecular, para que
pueda determinarse el tamaño de los fragmentos en la muestra de PCR.
Los
fragmentos de ADN de la misma longitud forman una "banda" en el gel
que se puede identificar a simple vista si el gel se tiñe con un pigmento que
se una al ADN. Por ejemplo, una reacción de PCR que produce un fragmento
de 400400400 pares de bases (pb) se
vería así en un gel:
Carril izquierdo: marcador de ADN con bandas de 100, 200, 300, 400
y 500 pb.
Carril derecho: resultado de la reacción de PCR, una banda de 400
pb.
Una banda de ADN contiene muchas,
muchas copias de la región blanco de ADN, no solo una o unas cuantas copias.
Dado que el ADN es microscópico, deben existir muchas copias de este para poder
verlo a simple vista. Esto es una parte importante de por qué la PCR es una
herramienta importante: produce suficientes copias de una secuencia de ADN para
poder ver o manipular esa región de ADN.
Aplicaciones de la PCR
Mediante el uso de la PCR, una
secuencia de ADN se puede amplificar millones o miles de millones de veces y
producirá suficientes copias de ADN para que se analicen mediante otras
técnicas. Por ejemplo, el ADN se puede visualizar por electroforesis en gel,
enviar a secuenciar o digerir con enzimas de restricción y clonar en un plásmido.
La PCR se utiliza en muchos
laboratorios de investigación, y también tiene aplicaciones prácticas en
medicina forense, pruebas genéticas y diagnósticas. Por ejemplo, la PCR se
utiliza para amplificar genes asociados con trastornos genéticos a partir del
ADN de los pacientes (o de ADN fetal, en el caso de pruebas prenatales). La PCR
también puede utilizarse para detectar el ADN de una bacteria o un virus en el
cuerpo de un paciente: si el patógeno está presente, es posible amplificar
regiones de su ADN de una muestra de sangre o tejido.
Problema de ejemplo: la PCR en ciencias forenses
Imagina que trabajas en un
laboratorio forense. Acabas de recibir una muestra de ADN de un cabello
encontrado en la escena de un crimen junto con muestras de ADN de tres posibles
sospechosos. Tu trabajo es examinar un marcador genético determinado y ver si
alguno de los tres sospechosos coincide con el ADN del cabello para este
marcador.
El marcador se presenta en dos
alelos o versiones. Uno contiene una secuencia repetida una vez (región marrón
en la siguiente imagen) y el otro contiene la secuencia repetida dos veces. En
una reacción de PCR con cebadores que flanquean la región con las secuencias
repetidas, el primer alelo produce un fragmento de ADN de 200200200 \text{pb}pbp, b y el
segundo produce un fragmento de 300300300 \text{pb}pbp,
b:
Alelo marcador 1: los cebadores que flanquean la región de
secuencias repetidas amplifican un fragmento de 200 pb de ADN.
Alelo marcador 2: los cebadores flanquean la región de repetidas
amplifican un fragmento de 300 pb de ADN
Realizas
PCR para las cuatro muestras de ADN y visualizas los resultados por
electroforesis en gel, como se muestra a continuación:
El gel tiene cinco carriles:
Primer carril: marcador de ADN con bandas de 100, 200, 300, 400 y
500 pb.
Segundo carril: ADN de la escena del crimen, banda de 200 pb.
Tercer carril: ADN del sospechoso #1, banda de 300 pb.
Cuarto carril: ADN del sospechoso #2, bandas de 200 y 300 pb.
Quinto carril: ADN del sospechoso #3, banda de 200 pb.
¿Cuál
es el sospechoso cuyo ADN coincide con el de la escena del crimen para este
marcador?
Más
sobre PCR y análisis forense
En pruebas forenses reales de ADN
para una escena del crimen, los técnicos harían un análisis conceptualmente
similar al del ejemplo anterior. Sin embargo, se compararía un número de
diversos marcadores (no solo un marcador como en el ejemplo) entre el ADN de la
escena del crimen y el ADN de los sospechosos.
Además, los marcadores utilizados
en un análisis forense típico no tienen solo dos formas diferentes. Por el
contrario, son altamente polimórficos (poli =
muchos, morfo = forma). Es decir, se presentan en muchos
alelos que varían en pequeños incrementos de longitud.
El tipo de marcador más usado en
el análisis forense, llamado repeticiones cortas en tándem (STR, por sus
siglas en inglés), consiste en muchas copias repetidas de la misma secuencia
corta de nucleótidos (de 222 a 555 nucleótidos de largo, por lo general).
Al examinar múltiples marcadores,
cada uno de los cuales presenta muchas formas alélicas, los científicos forenses
pueden construir una "huella dactilar" genética única a partir de una
muestra de ADN. En un análisis típico de STR que utiliza 131313 marcadores,
la probabilidad de un falso positivo (que dos personas tengan la misma
"huella dactilar" de ADN) ¡es menor a 111 en 101010.
Aunque se pueda pensar que las
pruebas de ADN se usan para condenar a los criminales, también han jugado un
papel crucial en exonerar personas falsamente acusadas (incluso algunas que
tenían muchos años encarceladas). El análisis forense también se usa para
determinar paternidad y para identificar restos humanos en escenas de desastre.
El vector
que se utiliza contiene secuencias de ADN que al ser replicadas confieren
resistencia a antibióticos específicos. Esta técnica ha sido ampliamente
utilizada en el campo de la medicina y ha permitido el desarrollo de
importantes avances terapéuticos como por ejemplo la producción de insulina
recombinante.2
Permite
además la posibilidad de utilizar plantas y alimentos transgénicos, así como microorganismos modificados genéticamente para
producir fármacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los
que se pueden citar: la insulina humana,
la hormona del crecimiento, interferones, la obtención de nuevas vacunas o la clonación de animales.
Con el
uso de ADN recombinante se ha logrado obtener plantas transgénicas resistentes
a insectos, hongos, bacterias y herbicidas, con mejores
características de calidad durante poscosecha y con alto contenido nutricional.4 También ha permitido la clonación, expresión y producción mediante esta técnica de diversos antígenos, por ejemplo, la vacuna contra la
hepatitis B5 y la vacuna
contra el virus del papiloma humano.6
Producción y terapia con proteínas recombinantes
Las
proteínas recombinantes son aquellas que se producen mediante la técnica del
ADN recombinante, es decir, expresando un gen de un organismo en otro organismo
distinto. Para que estas proteínas sean útiles desde el punto de vista
terapéutico tienen que conservar su actividad. Además, se debe evitar que sean
inmunogénicas para el ser humano. Para ello es importante decidir para cada
proteína recombinante cual es el organismo de expresión más adecuado.
Producción en bacterias
Estas proteínas
recombinantes han intentado expresarse en bacterias como E. coli, ya que son
fáciles de mantener, crecen rápido y se conoce bien su genoma. Sin embargo, el
mayor problema que presenta la producción en bacterias es que en ellas no
existe glicosilación proteica, por lo que algunas proteínas producidas en
bacterias pierden totalmente su función. Aun así se han logrado producir con
éxito algunas proteínas recombinantes en bacterias. La primera proteína
recombinante que se produjo en E. coli fue la somatostatina, una hormona
anti-crecimiento de 14 aminoácidos. Sin embargo, aunque desde el punto de vista
científico fue un éxito, desde el punto de vista económico fue un fracaso, ya
que su utilidad estaba reducida a personas con problemas de gigantismo y
similares, que son poco comunes. Posteriormente se logró un gran éxito en este
campo mediante la producción de insulina en bacterias. La insulina presenta la
ventaja de no necesitar modificaciones postraduccionales, por lo que se evita
este problema de su producción en bacterias. Además, la diabetes es una
enfermedad muy frecuente en la sociedad, con unos 347 millones de diabéticos.
En EEUU el 6% de la población (20 millones de habitantes) son diabéticos y esta enfermedad es la 6ª causa de muerte. Antes de esta
producción en bacterias, se usaba insulina porcina.
Producción en levaduras
Al ser
células eucariotas y por lo tanto más similares a las humanas que las bacterias
y ser muy fáciles de emplear industrialmente, las levaduras constituyen otro
grupo de organismos susceptibles de producir proteínas recombinantes para uso
humano. Sin embargo, aunque sí presentan glicosilación proteica, al contrario
que las bacterias, esta es totalmente distinta a la humana, por lo que estas
proteínas presentan problemas, en muchos casos incluso inmunogénicos.
Producción en células de insecto
Más
cercanas aún a las células humanas que las levaduras son las de insecto, como
las de Spodoptera frugiperda (una polilla parásito del maíz y del algodón), que
se cultivan fácilmente in Vitro, aunque el medio de cultivo es caro. Dicho
medio, además, no contiene suero, lo que hace más fácil el procesado de la
proteína. Otra de las propuestas ha sido el uso no de células de insecto, sino
de los insectos completos para la producción de estas proteínas. Para ello se
infectan a los insectos con baculovirus modificados (que además no infectan a
los seres humanos) para que expresen la proteína recombinante. Sin embargo,
este sistema presenta exactamente el mismo problema que el de levaduras: que
las células de insecto presentan glicosilación, pero esta es totalmente
distinta a la de mamíferos.
Producción en células de mamífero
Al ser
células más parecidas a las humanas, el procesamiento que sufren las proteínas
recombinantes producidas en células de mamífero también es más similar, por lo
que se conserva su función (aunque puede haber ligeros cambios en el patrón de
glicosilación). Los inconvenientes de este método es que el crecimiento celular
es más lento, tardando de 6 a 24 horas en duplicarse las células, que los
cultivos pueden sufrir contaminación de bacterias u hongos y que se puede
contaminar el producto con virus que infecten a humanos. Para la producción en
mamíferos se usan las células CHO, de ovario de ratón chino, que presentan la
ventaja de que crecen bien y existen gran cantidad de mutantes de
glicosilación. Además, se está intentando que los animales secreten estas
proteínas en la orina, en la leche, etc.
