TP N°5- Tinciones para microscopía

Tema: Tinciones para microbiología

FUNDAMENTO

Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más de un siglo han ayudado al diagnóstico de enfermedades infecciosas y en la caracterización de nuevas especies. Existe una gran variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes agentes infecciosos en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos. La tinción de Gram se considera básica en la valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico, mientras que la tinción de Wright se ocupa para el diagnóstico de enfermedades muy particulares en el campo de la parasitología.

Existen técnicas de tinción específicas de gran utilidad, como la tinción de Ziehl-Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas como la tuberculosis o la actinomicosis, o la tinción de azul de lactofenol, que preserva e identifica a los componentes estructurales de los hongos. Las diferentes tinciones en el laboratorio microbiológico tienen una utilidad fundamental para el diagnóstico y tratamiento oportuno de múltiples patologías de etiología infecciosa (1).

La observación microscópica puede efectuarse mediante el examen en fresco de una suspensión microbiana, lo que permite visualizar microorganismos vivos y reconocer sus movimientos, apreciar sus distintas formas, tamaños y agrupaciones, o mediante un extendido o frotis coloreado, lo que posibilita según la técnica utilizada, diferencias microorganismos, observar su morfología, tamaño y agrupación o la observación de ciertos elementos facultativos como flagelos, capsula ó endosporas (2).

Los colorantes utilizados en microbiología son sales, las cuales tienen un ion cargado positivamente y otro negativamente, de los cuales uno está coloreado. Cuando el ion está coloreado es el cargado negativamente, el colorante se clasifica como aniónico o acido, por ejemplo, el eosinato de sodio, el cual se ioniza como sodio+ y eosinato+. Cuando el ión coloreado es el cargado positivamente, el colorante se clasifica como catiónico o básico, por ejemplo el azul de metileno, el cual se ioniza como cloruro- y azul de metileno+ (3).

Al poner en contacto una célula bacteriana con un colorante ocurre un intercambio de iones entre el colorante y los sitios activos de las superficies o el interior de la célula. Los iones teñidos del colorante reemplazan a los iones de los componentes celulares, así, por ejemplo, el catión azul de metileno+ reemplaza al catión Na+ de las células dándoles color (3).

Según la estructura que el colorante tiñe en la bacteria, las coloraciones se han clasificado en : coloraciones simples, en las que sólo se emplea un colorante para el proceso, ejemplo azul de metileno; coloraciones compuestas y diferenciales, en las cuáles se usa más de un colorante y con la misma colo ración , las células se tiñen de manera diferente, ejemplo Gram, Ziehl Neelsen, y coloraciones especiales que permiten la observación de estructuras especiales de la bacteria como endosporas, glicocaliz, capsulas, flagelos (3,4).

En la práctica de Tinciones los estudiantes realizarán técnicas simples como la tinción con azul de metileno y Diferenciales como la Tinción de Gram para diferenciar las bacterias en Gram (+) y Gram (-) Teniendo en cuenta la composición química de su pared celular (peptidoglucano). Una coloración negativa para tinción de cápsulas bacterianas, tinción de Ziehl Neelsen para identificación de bacterias acido alcohol resistente y la tinción de Shaeffer Fulton para la tinción de endosporas (4).

La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en bacterias Gram positivas y Gram negativas. La reacción de la tinción de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares de estas bacterias (Figura 1).

Metodología

4.1 Procedimiento

Caracterización macroscópica:

A partir de los cultivos de bacterias en medio sólido, describir las características que observa, teniendo en cuenta el color, aspecto y consistencia de las colonias de los microorganismos en el medio de cultivo.

Realización de frotis:

·         A partir de medio líquido: Cargue el asa bacteriológica con una gota de cultivo y deposítela en un portaobjetos limpio realizando una extensión en forma circular de la muestra hasta conseguir una capa fina (frotis).

·         A partir de un medio sólido: Ponga una gota de solución salina fisiológica (NaCl 0,9%) estéril en el portaobjetos. A continuación cargue el asa con una pequeña cantidad de bacterias de una colonia del cultivo y re suspéndala en la gota hasta homogeneizar. Hágalo de forma circular.

Fijación al Calor:

·         La preparación se deja secar al aire libre, cerca al mechero.

·         Una vez seca, se procede a la fijación, haciendo pasar la preparación 3-4 veces por la llama del mechero (la llama debe tocar la parte posterior del portaobjetos).

·          A partir de este momento la preparación está lista para teñir y el procedimiento a seguir depende del tipo de tinción

Tinciones a realizar:

Coloración de azul de metileno (Tinción simple)

Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula.

Procedimiento:

·         Tome una muestra de los cultivos de Escherichia coli y Bacillus spp.

·         Fije al calor la muestra.

·         Cubrir con azul de metileno la preparación y esperar 2 minutos.

·         Lavar con agua.

·         Secar al aire y pasar por el mechero tres veces.

·         Observar al microscopio hasta llegar al objetivo de 100x utilizando aceite de inmersión.

Metodología

4.1 Procedimiento

Caracterización macroscópica:

A partir de los cultivos de bacterias en medio sólido, describir las características que observa, teniendo en cuenta el color, aspecto y consistencia de las colonias de los microorganismos en el medio de cultivo.

Realización de frotis:

·         A partir de medio líquido: Cargue el asa bacteriológica con una gota de cultivo y deposítela en un portaobjetos limpio realizando una extensión en forma circular de la muestra hasta conseguir una capa fina (frotis).

·         A partir de un medio sólido: Ponga una gota de solución salina fisiológica (NaCl 0,9%) estéril en el portaobjetos. A continuación cargue el asa con una pequeña cantidad de bacterias de una colonia del cultivo y re suspéndala en la gota hasta homogeneizar. Hágalo de forma circular.

Fijación al Calor:

·         La preparación se deja secar al aire libre, cerca al mechero.

·         Una vez seca, se procede a la fijación, haciendo pasar la preparación 3-4 veces por la llama del mechero (la llama debe tocar la parte posterior del portaobjetos).

·         A partir de este momento la preparación está lista para teñir y el procedimiento a seguir depende del tipo de tinción

Tinciones a realizar:

Coloración de azul de metileno (Tinción simple)

Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula.

Procedimiento:

·         Tome una muestra de los cultivos de Escherichia coli y Bacillus spp.

·         Fije al calor la muestra.

·         Cubrir con azul de metileno la preparación y esperar 2 minutos.

·         Lavar con agua.

·         Secar al aire y pasar por el mechero tres veces.

·         Observar al microscopio hasta llegar al objetivo de 100x utilizando aceite de inmersión.

Coloración de Gram (Tinción Diferencial)

Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram negativas, mientras que en las Gram positivas el colorante queda retenido y las células permanecerán azules-púrpuras. Las células Gram negativas se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse, estas quedan rosadas.

Procedimiento (Figura 2):

·         Realice el montaje de los cultivos de Escherichia coli y Staphylococcus spp.

·         Añadir 1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación, hasta que se cubra por completo. Dejar actuar el colorante durante 1 minuto. Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparación con agua.

·         Agregar 1 ó 2 gotas de solución lugol a la preparación, y dejar actuar 1 minuto.

·         Transcurrido el tiempo, lavar con agua.

·         Con cuidado, añadir gota a gota el alcohol-acetona dejar actuar 30 segundos, luego lavar con agua

·         Añadir el colorante de contraste, safranina-fushina (1 ó 2 gotas) y dejar actuar durante 1 minuto luego lavar con agua

·         Escurra y deje secar al aire

·         observar al microscopio a 100X con aceite de inmersión.

·         Dibuje sus observaciones.

Figura 2. Adición de colorantes de Gram (7)

Figura 3.a) Bacilos Gram negativos b) Cocos Gram positivos (8)

Coloración con tinta china para cápsula

Se suspenden las bacterias en tinta china, fundamentado en que las partículas de carbón no penetran las cápsulas, las mismas aparecen claras sobre un fondo oscuro (Figura 4).

Procedimiento:

·         Coloque una gota de tinta china sobre un portaobjetos y mezcle con una asada del cultivo de Klebsiella spp. formando un extendido sobre la lámina.

·         Deje secar al aire y fije brevemente con calor.

·         Lave, escurra y seque el frotis.

·         Observe con el objetivo de 100X con aceite de inmersión.

Figura 4. Tinción Negativa (capsula) (7)

Coloración de Shaeffer-Fulton para endospora (Tinción diferencial)

Las endosporas (figura 5) son formas de resistencia, altamente deshidratadas con una serie de cubiertas muy poco permeables, esto hace que sean difíciles de teñir, excepto si se calienta la preparación para permeabilizarlas; sin embargo, pueden evidenciarse en preparaciones en fresco o con diversas tinciones, pues las esporas aparecen como estructuras refringentes no coloreadas. Las esporas son producidas por Bacillus spp, Clostridium spp, géneros de bacterias Gram Positivas; aunque recientemente han sido descritas en algunas bacterias Gram negativas (4).

Procedimiento:

·         Realice el montaje del cultivo Bacillus spp y fijarlas al calor.

·         Cubra con verde de malaquita y caliente durante 5 minutos hasta emisión de vapores, sin que la preparación llegue a secarse. Adicionar más colorante cuando se esté secando.

·         Deje enfriar la lámina por 1 ó 2 minutos.

·         Lave con agua de llave por 30 segundos.

·         Cubra la preparación con safranina o fucsina de Gram por 30 segundos.

·         Lave, escurra, limpie el reverso de la lámina, deje secar.

·         Observe al microscopio con el objetivo de 100X con aceite de inmersión.

Figura 5. Endosporas con tinción Shaeffer Fulton (7)

4.2 Materiales, reactivos y equipos

Tabla 1. Materiales, reactivos y equipos a utilizar

* Deben ser llevados a la práctica por los estudiantes.

NOTA: Los anteriores materiales están calculados para cada grupo de laboratorio, es decir para realizar la solicitud debe calcularse la cantidad total de acuerdo a los grupos de trabajo que se tengan. Tenga en cuenta que los cálculos son para caja grande de agar.

Preguntas de profundización para entregar---------- Fecha: 5/6 /2020

• Hazte un ATLAS (recopilación de imágenes) con las imágenes de los distintos tipos de tinción que aquí se detallan. Coloca imágen y debajo a qué tipo de tinción corresponde. (puedes agregar alguna característica importante de la tinción)

·         ¿Investiga y explica cuál es la importancia de las tinciones en el estudio de los microorganismos?

·         ¿Cuál es la tinción que se utiliza para la tinción de BAAR (Bacterias acido alcohol resistentes)? ¿Cuál es el fundamento de la Tinción?

·         ¿Cuál tinción se utiliza para la tinción de flagelos? Explique el fundamento de la Tinción.

·         ¿Cuál tinción se utiliza para la tinción gránulos de reserva? Explique el fundamento de la Tinción.

·         Investiga ¿Qué es un colorante catiónico? Dé 2 ejemplo

·         Investiga ¿Qué es un colorante aniónico? De 2 ejemplos

·         ¿Cuál es el decolorante que se emplea en la tinción de Gram?

TPN°4- Microscopía óptica

Tema: MICROSCOPIA ÓPTICA

Fundamentación: En al microscopio óptico (también llamado fotónico o lumínico), el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos.

Consta de dos partes: una mecánica y otra óptica:

A) Parte mecánica: - Base: sostiene el aparato. - Columna o brazo: sostiene al tubo y lleva adosado los tornillos de movimiento. - Tubo: sostiene en le parte superior al ocular y en la inferior al revólver donde se atornillan los distintos objetivos. - Tornillos de movimiento: Macrométrico: sube o baja rápidamente la platina, dando un enfoque aproximado del preparado. Micrométrico: permite un enfoque exacto del preparado. - Platina: sostiene la preparación a observar, posee un orificio central que permite el paso de la luz proveniente del aparato de iluminación. Posee tornillos de desplazamiento de derecha a izquierda y de adelante hacia atrás. Dos pinzas evitan que el preparado se corra.

B) Parte óptica: - Objetivos: sistemas de lentes convergentes que forman una imagen real, aumentada e invertida.

Existen 2 tipos:

a) Secos: son los de menor aumento, dejan una capa de aire entre la lente y el preparado y

b) De inmersión: se logran aumentos mayores, interpone entre la lente y el preparado aceite de cedro o aceite para inmersión, líquido con un índice de refracción similar al cristal de la lente, que evita la desviación de los rayos luminosos al pasar por un medio de índice distinto (aire). – Ocular: sistema de lentes convergentes, destinado a corregir y aumentar la imagen dada por el objetivo, logrando una imagen virtual, aumentada y derecha.

El microscopio puede ser mono o binocular. - Aparato de iluminación: formado por el condensador, diafragma, la fuente de luz y los filtros de luz.

Propiedades de las lentes

·         Poder de resolución: es la capacidad de dar los detalles más finos entre dos puntos del objeto situados muy próximos entre sí. –

·         Límite de resolución: distancia mínima a partir de la cual ya no se puede distinguir la separación que existe entre dos puntos.

·         Aumento total: es el producto del aumento del ocular por el aumento del objetivo. - Poder de definición: capacidad de formar imágenes claras y de contornos nítidos. - Distancia focal: distancia existente entre el centro de la lente y el foco. Medidas utilizadas en microscopía 1 centímetro (cm) = 1/100 metros 1 milímetro (mm) = 1/1.000 metros = 1/10 cm 1 micrómetro (µm) = 1/1.000.000 metros = 1/10.000 cm 1 nanómetro (nm) = 1/1.000.000.000 metros = 1/10.000.000 cm 1 angstrom (Å) = 1/10.000.000.000 metros = 1/100.000.000 cm 1metro = 102 cm = 103 mm = 106 µm = 109 nm = 1010 Å

Otros tipos de microscopios:

Microscopio electrónico de transmisión (MET): es un microscopio que utiliza un haz de electrones para visualizar un objeto, debido a que la potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible. Lo característico de este microscopio es el uso de una muestra ultrafina y que la imagen se obtenga de los electrones que la atraviesan. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.

Microscopio electrónico de barrido (MEB): también emplea un haz de electrones en lugar de un haz de luz para formar una imagen, pero en este caso la muestra es recubierta con una capa de carbón o de un metal y posteriormente es barrida con los electrones acelerados. Tiene una gran profundidad de campo, la cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la muestra. También produce imágenes de alta resolución, que significa que características espacialmente cercanas en la muestra pueden ser examinadas a una alta magnificación.

Microscopios de luz polarizada: son microscopios a los que se les añaden dos polarizadores (uno entre el condensador y la muestra y el otro entre la muestra y el observador). El material que se usa para ello es un cristal de cuarzo y un cristal de Nicol, dejando pasar únicamente la luz que vibra en un único plano (luz polarizada). Esta luz produce en el campo del microscopio claridad u oscuridad, según que los dos nicoles estén paralelos o cruzados.

Microscopio de fluorescencia: es una variación del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos. Microscopio de contraste de fases: permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados. Microscopio de campo oscuro: utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás. Por ello, las porciones transparentes del espécimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partículas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones, incluida la del eje óptico que conecta el espécimen con la pupila del observador.

Forma correcta de enfocar en el microscopio óptico

1-     Colocar el preparado con el cubreobjetos hacia arriba, fijándolo con las pinzas de la platina.

2-    Encender la fuente de luz, no usar el máximo de luz.

3-    Subir la platina utilizando el tornillo macrométrico, mirando por el costado para evitar que la lente rompa el preparado.

4-    Desplazar suavemente la platina, observando por el ocular hasta que aparezca la imagen, obteniendo el enfoque correcto con un leve movimiento del tornillo micrométrico.

5-    Girar el revólver sin modificar la posición de la platina, para cambiar a un objetivo de mayor aumento, mirando por el costado cuidando que la lente no roce la preparación, para evitar que ambas se dañen. Moviendo el micrométrico se logra la nitidez deseada.

Forma de usar el objetivo de inmersión

1-     Colocar una gota de aceite para microscopía sobre el preparado en la zona que desea observar.

2-    Enfocar con el objetivo de menor aumento.

3-    Girar el revólver de modo que el objetivo de inmersión (100X) quede en el eje óptico, cuidando que los otros objetivos no toquen el aceite, pues resultarían dañados.

4-    Subir la platina utilizando el tornillo macrométrico, mirando por el costado hasta que la gota de aceite toque el objetivo de 100X.

5-    Desplazar suavemente la platina, observando por el ocular hasta que aparezca la imagen, obteniendo el enfoque correcto con un leve movimiento del tornillo micrométrico.

·         Técnicas de preparación de la muestra

El material biológico a estudiar debe ser convenientemente tratado para que reúna las condiciones de transparencia, grosor y tamaño adecuadas. Existen dos tipos de preparaciones citológicas: a) temporales: se hacen en el momento y luego se desechan, son fáciles de preparar pero no se pueden conservar por mucho tiempo y no permiten estudios detallados y b) permanentes: se conservan por mucho tiempo, permiten un estudio profundo pero requieren técnicas complejas y prolongadas. En microscopía óptica las técnicas comúnmente empleadas son: 

1.- Frotis o extendido: utilizado para estudiar suspensiones celulares como sangre, bacterias y células de la mucosa bucal. Se coloca una gota de muestra sobre un portaobjetos y se extiende. Se observa directamente o luego de realizar fijación y coloración.

2.- Aplastamiento o “squash”: se coloca el material previamente ablandado entre porta y cubreobjetos y se presiona con fuerza aplastando. Se puede observar directamente o previa fijación y coloración.

3.- Cortes: esta técnica se utiliza para realizar preparados permanentes o temporales. Para preparados permanentes se siguen los pasos detallados a continuación:

·         Fijación:

Se trata la muestra con algún método físico o químico que mata las células pero no altera su estructura y composición. La muestra debe estar seccionada en trozos pequeños que no deben tener más de 0,5 a 1 mm de espesor.

·         Inclusión:

Para que el material pueda ser cortado es necesario infiltrarlo en un material consistente. En microscopía óptica se usa generalmente parafina o celoidina y en microscopía electrónica resinas epóxicas.

·         Corte:

El tejido debe seccionarse en cortes muy finos para permitir el paso de la luz o los electrones (microscopio electrónico). Se hacen con un instrumento llamado micrótomo. Para ser observados en un microscopio electrónico los cortes deben ser ultrafinos (200 Ǻ de espesor) y se utilizan ultramicrótomos.

·         Montaje:

Es la adhesión del material al porta y cubreobjetos, se usa generalmente DePex o Bálsamo de Canadá. En microscopía electrónica el portaobjetos se reemplaza por una rejilla de alambre. • Coloración: para destacar determinadas estructuras. Para preparados temporales en tejidos animales y vegetales, se emplea navaja, bisturí u hoja de afeitar de la siguiente manera: • Se hace un corte en el material para producir una superficie lisa. • Se aplica el filo del bisturí sobre la superficie y se impulsa con suavidad, lenta y uniformemente. • Elementos muy jugosos deben ser fijados previamente con alcohol de mediana concentración. • Las secciones logradas se toman con el bisturí, se depositan junto con una gota de agua en el centro del portaobjetos utilizando un pincel de pelo fino humedecido y luego se cubren con un cubreobjetos. Sustancias utilizadas en las preparaciones para microscopía Fijadores: matan rápidamente a la célula y conservan su estructura y composición química semejante al estado vivo. Fijadores químicos: coagulan o precipitan las proteínas y endurecen los tejidos; los más usados son alcohol etílico y formol. En microscopía electrónica se usa el tetróxido de osmio y el glutaraldehído. Fijadores físicos: detienen los procesos vitales por acción física y los más utilizados son calor, congelación y desecación. Colorantes: tiñen selectivamente ciertas estructuras, dependiendo de su grupo cromóforo (el que da color). Pueden ser: a) Ácidos: son colorantes citoplasmáticos, por ejemplo: eosina y azul de anilina. b) Básicos: son colorantes nucleares, por ejemplo: azul de metileno, azul de toluduina y cristal violeta. c) Neutros: tiñen el núcleo de un tono y el citoplasma de otro, por ejemplo: eosinato de azul de metileno, rojo neutro y rojo fenol. En microscopía electrónica se emplean soluciones de metales pesados como el plomo (Pb). La mayoría de las técnicas de coloración no pueden aplicarse a células vivas.

Reactivos: se utilizan para detectar la presencia de ciertos componentes químicos que interesa identificar reaccionando químicamente con ellos. Por ejemplo el lugol (solución yodo – iodurada), de color pardo, es un reactivo específico del almidón (blanco); al ponerse en contacto originan un nuevo compuesto de color azul violáceo, detectando así la presencia de almidón.

Actividad: fecha de entrega (29/05/2020)

a) busca un vídeo en youtube que te parezca más explicativo en el funcionamiento del microscopio óptico.

b) busca una imagen sencilla de un microscopio óptico e indica las partes.