Tema:
Tinciones para microbiología
FUNDAMENTO
Las tinciones en microbiología son las
primeras herramientas que se utilizan en
el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde
hace más de un siglo han ayudado al diagnóstico de enfermedades infecciosas y
en la caracterización de nuevas especies. Existe una gran variedad de
tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes
agentes infecciosos en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos. La tinción de Gram se
considera básica en la valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico,
mientras que la tinción de Wright se ocupa para el diagnóstico de enfermedades
muy particulares en el campo de la parasitología.
Existen técnicas de tinción específicas de
gran utilidad, como la tinción de
Ziehl-Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas como
la tuberculosis o la actinomicosis,
o la tinción de azul de lactofenol, que preserva e identifica a los componentes
estructurales de los hongos. Las diferentes tinciones en el laboratorio
microbiológico tienen una utilidad fundamental para el diagnóstico y
tratamiento oportuno de múltiples patologías de etiología infecciosa (1).
La observación microscópica puede efectuarse
mediante el examen en fresco de una suspensión microbiana, lo que permite visualizar
microorganismos vivos y reconocer sus movimientos, apreciar sus distintas
formas, tamaños y agrupaciones, o mediante un extendido o frotis coloreado, lo
que posibilita según la técnica utilizada, diferencias microorganismos,
observar su morfología, tamaño y agrupación o la
observación de ciertos elementos facultativos como flagelos, capsula ó
endosporas (2).
Los colorantes utilizados en microbiología son
sales, las cuales tienen un ion cargado positivamente y otro negativamente, de
los cuales uno está coloreado. Cuando el ion está coloreado es el cargado
negativamente, el colorante se clasifica como aniónico o acido, por ejemplo, el
eosinato de sodio, el cual se ioniza como sodio+ y eosinato+. Cuando el ión
coloreado es el cargado positivamente, el colorante se clasifica como catiónico
o básico, por ejemplo el azul de metileno, el cual se ioniza como cloruro- y
azul de metileno+ (3).
Al poner en contacto una célula bacteriana con un
colorante ocurre un intercambio de iones entre el colorante y los sitios activos de las superficies o
el interior de la célula. Los iones teñidos del
colorante reemplazan a los iones de los componentes celulares, así, por
ejemplo, el catión azul de metileno+ reemplaza al catión Na+ de las células dándoles color (3).
Según la estructura que el colorante
tiñe en la bacteria, las coloraciones se han clasificado en : coloraciones
simples, en las que sólo se emplea un colorante para el proceso, ejemplo azul de
metileno; coloraciones compuestas y diferenciales, en las cuáles se usa más de
un colorante y con la misma colo ración , las células se tiñen de manera
diferente, ejemplo Gram, Ziehl Neelsen, y coloraciones especiales que permiten
la observación de estructuras especiales de la bacteria como endosporas,
glicocaliz, capsulas, flagelos (3,4).
En la práctica de Tinciones los estudiantes
realizarán técnicas simples como la tinción con azul de metileno y
Diferenciales como la Tinción de Gram para diferenciar las bacterias en Gram
(+) y Gram (-) Teniendo en cuenta la composición química de su pared celular (peptidoglucano).
Una coloración negativa para tinción de cápsulas bacterianas, tinción de Ziehl
Neelsen para identificación de bacterias acido alcohol resistente y la
tinción de Shaeffer Fulton para la tinción de endosporas (4).
La tinción propuesta por el médico danés Christian
Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales más utilizadas en
bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en
bacterias Gram positivas y Gram negativas. La reacción de la tinción de Gram se
basa en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares
de estas bacterias (Figura 1).
Metodología
4.1 Procedimiento
Caracterización macroscópica:
A partir de los cultivos de bacterias en medio
sólido, describir las características que observa, teniendo en cuenta el color,
aspecto y consistencia de las colonias de los microorganismos en el medio de
cultivo.
Realización de frotis:
·
A
partir de medio líquido: Cargue el asa bacteriológica con una gota de
cultivo y deposítela en un portaobjetos limpio realizando una extensión en
forma circular de la muestra hasta conseguir una
capa fina (frotis).
·
A
partir de un medio sólido: Ponga una gota de solución salina fisiológica (NaCl
0,9%) estéril en el portaobjetos. A continuación cargue el asa con
una pequeña cantidad de bacterias de una colonia del cultivo y re
suspéndala en la gota hasta homogeneizar. Hágalo de forma circular.
·
Una
vez seca, se procede a la fijación, haciendo pasar la preparación 3-4
veces por la llama del mechero (la llama debe tocar la parte posterior del
portaobjetos).
·
A partir de este momento
la preparación está lista para teñir y el procedimiento a seguir depende del
tipo de tinción
Tinciones a realizar:
Coloración de azul de metileno (Tinción simple)
Permite teñir el interior celular. Tiñe
microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen
si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se
tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula.
Procedimiento:
·
Tome
una muestra de los cultivos de Escherichia
coli y Bacillus
spp.
·
Fije
al calor la muestra.
·
Cubrir
con azul de metileno la preparación y esperar 2 minutos.
·
Secar
al aire y pasar por el mechero tres veces.
Metodología
4.1 Procedimiento
Caracterización macroscópica:
A partir de los cultivos de bacterias en medio
sólido, describir las características que observa, teniendo en cuenta el color,
aspecto y consistencia de las colonias de los microorganismos en el medio de
cultivo.
Realización de frotis:
·
A
partir de medio líquido: Cargue el asa bacteriológica con una gota de
cultivo y deposítela en un portaobjetos limpio realizando una extensión en
forma circular de la muestra hasta conseguir una
capa fina (frotis).
·
A
partir de un medio sólido: Ponga una gota de solución salina fisiológica (NaCl
0,9%) estéril en el portaobjetos. A continuación cargue el asa con
una pequeña cantidad de bacterias de una colonia del cultivo y re
suspéndala en la gota hasta homogeneizar. Hágalo de forma circular.
·
Una
vez seca, se procede a la fijación, haciendo pasar la preparación 3-4
veces por la llama del mechero (la llama debe tocar la parte posterior del
portaobjetos).
·
A
partir de este momento la preparación está lista para teñir y el procedimiento a seguir depende del
tipo de tinción
Tinciones a realizar:
Coloración de azul de metileno (Tinción simple)
Permite teñir el interior celular. Tiñe
microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen
si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se
tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula.
Procedimiento:
·
Tome
una muestra de los cultivos de Escherichia
coli y Bacillus
spp.
·
Fije
al calor la muestra.
·
Cubrir
con azul de metileno la preparación y esperar 2 minutos.
·
Secar
al aire y pasar por el mechero tres veces.
Coloración de Gram (Tinción Diferencial)
Tras la tinción con el primer colorante (Cristal
violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en
las Gram negativas, mientras que en las Gram positivas el colorante queda
retenido y las células permanecerán azules-púrpuras. Las células Gram negativas
se teñirán después con un
colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse, estas quedan
rosadas.
Procedimiento (Figura 2):
·
Realice
el montaje de los cultivos de Escherichia
coli y Staphylococcus
spp.
·
Añadir
1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación, hasta que se cubra por
completo. Dejar actuar el colorante durante 1 minuto. Una vez transcurrido
el tiempo, lavar la preparación con
agua.
·
Agregar
1 ó 2 gotas de solución lugol a la preparación, y dejar actuar 1 minuto.
·
Transcurrido
el tiempo, lavar con agua.
·
Con
cuidado, añadir gota a gota el alcohol-acetona dejar actuar 30 segundos, luego
lavar con agua
·
Añadir
el colorante de contraste, safranina-fushina (1 ó 2 gotas) y dejar actuar
durante 1 minuto luego lavar con agua
·
Escurra
y deje secar al aire
·
observar
al microscopio a 100X con aceite de inmersión.
·
Dibuje
sus observaciones.
Figura 2. Adición de colorantes de Gram (7)
Figura 3.a) Bacilos Gram negativos b) Cocos Gram
positivos (8)
Se suspenden las bacterias en tinta china,
fundamentado en que las partículas de carbón no penetran las cápsulas, las
mismas aparecen claras sobre un fondo oscuro (Figura 4).
Procedimiento:
·
Coloque
una gota de tinta china sobre un portaobjetos y mezcle con una asada del cultivo
de Klebsiella spp.
formando un extendido sobre la lámina.
·
Deje
secar al aire y fije brevemente con calor.
·
Lave,
escurra y seque el frotis.
·
Observe
con el objetivo de 100X con aceite de inmersión.
Figura 4. Tinción Negativa (capsula) (7)
Coloración de Shaeffer-Fulton para endospora
(Tinción diferencial)
Las endosporas (figura 5) son formas de resistencia, altamente deshidratadas
con una serie de cubiertas muy poco permeables, esto hace que sean difíciles de
teñir, excepto si se calienta la preparación para permeabilizarlas; sin
embargo, pueden evidenciarse en preparaciones en fresco o con diversas
tinciones, pues las esporas aparecen como estructuras refringentes no coloreadas.
Las esporas son producidas por Bacillus spp, Clostridium spp, géneros
de bacterias Gram Positivas; aunque recientemente han sido descritas en algunas
bacterias Gram negativas (4).
Procedimiento:
·
Realice
el montaje del cultivo Bacillus spp
y fijarlas al calor.
·
Cubra
con verde de malaquita y caliente durante 5 minutos hasta emisión de vapores,
sin que la preparación llegue a secarse. Adicionar más colorante cuando se esté
secando.
·
Deje
enfriar la lámina por 1 ó 2 minutos.
·
Lave
con agua de llave por 30 segundos.
·
Cubra
la preparación con safranina o fucsina de Gram por 30 segundos.
·
Lave,
escurra, limpie el reverso de la lámina, deje secar.
·
Observe
al microscopio con el objetivo de 100X con aceite de inmersión.
Figura 5. Endosporas con tinción Shaeffer Fulton (7)
Tabla 1. Materiales, reactivos y equipos a utilizar
* Deben ser llevados a la práctica por los
estudiantes.
NOTA: Los anteriores materiales están calculados
para cada grupo de laboratorio, es
decir para realizar la solicitud debe calcularse la cantidad total de acuerdo a
los grupos de trabajo que se tengan. Tenga
en cuenta que los cálculos son para caja grande de agar.
Preguntas de profundización para entregar---------- Fecha: 5/6 /2020
·
¿Investiga y explica cuál es la importancia de las tinciones en el estudio de los
microorganismos?
·
¿Cuál
es la tinción que se utiliza para la tinción de BAAR (Bacterias acido alcohol
resistentes)? ¿Cuál es el fundamento de la Tinción?
·
¿Cuál
tinción se utiliza para la tinción de flagelos? Explique el fundamento de la
Tinción.
·
¿Cuál
tinción se utiliza para la tinción gránulos de reserva? Explique el fundamento
de la Tinción.
·
Investiga ¿Qué es un colorante catiónico? Dé 2 ejemplo
·
Investiga ¿Qué es un colorante aniónico? De 2 ejemplos
·
¿Cuál
es el decolorante que se emplea en la tinción de Gram?
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