TPN°4- Microscopía óptica

Tema: MICROSCOPIA ÓPTICA

Fundamentación: En al microscopio óptico (también llamado fotónico o lumínico), el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos.

Consta de dos partes: una mecánica y otra óptica:

A) Parte mecánica: - Base: sostiene el aparato. - Columna o brazo: sostiene al tubo y lleva adosado los tornillos de movimiento. - Tubo: sostiene en le parte superior al ocular y en la inferior al revólver donde se atornillan los distintos objetivos. - Tornillos de movimiento: Macrométrico: sube o baja rápidamente la platina, dando un enfoque aproximado del preparado. Micrométrico: permite un enfoque exacto del preparado. - Platina: sostiene la preparación a observar, posee un orificio central que permite el paso de la luz proveniente del aparato de iluminación. Posee tornillos de desplazamiento de derecha a izquierda y de adelante hacia atrás. Dos pinzas evitan que el preparado se corra.

B) Parte óptica: - Objetivos: sistemas de lentes convergentes que forman una imagen real, aumentada e invertida.

Existen 2 tipos:

a) Secos: son los de menor aumento, dejan una capa de aire entre la lente y el preparado y

b) De inmersión: se logran aumentos mayores, interpone entre la lente y el preparado aceite de cedro o aceite para inmersión, líquido con un índice de refracción similar al cristal de la lente, que evita la desviación de los rayos luminosos al pasar por un medio de índice distinto (aire). – Ocular: sistema de lentes convergentes, destinado a corregir y aumentar la imagen dada por el objetivo, logrando una imagen virtual, aumentada y derecha.

El microscopio puede ser mono o binocular. - Aparato de iluminación: formado por el condensador, diafragma, la fuente de luz y los filtros de luz.

Propiedades de las lentes

·         Poder de resolución: es la capacidad de dar los detalles más finos entre dos puntos del objeto situados muy próximos entre sí. –

·         Límite de resolución: distancia mínima a partir de la cual ya no se puede distinguir la separación que existe entre dos puntos.

·         Aumento total: es el producto del aumento del ocular por el aumento del objetivo. - Poder de definición: capacidad de formar imágenes claras y de contornos nítidos. - Distancia focal: distancia existente entre el centro de la lente y el foco. Medidas utilizadas en microscopía 1 centímetro (cm) = 1/100 metros 1 milímetro (mm) = 1/1.000 metros = 1/10 cm 1 micrómetro (µm) = 1/1.000.000 metros = 1/10.000 cm 1 nanómetro (nm) = 1/1.000.000.000 metros = 1/10.000.000 cm 1 angstrom (Å) = 1/10.000.000.000 metros = 1/100.000.000 cm 1metro = 102 cm = 103 mm = 106 µm = 109 nm = 1010 Å

Otros tipos de microscopios:

Microscopio electrónico de transmisión (MET): es un microscopio que utiliza un haz de electrones para visualizar un objeto, debido a que la potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible. Lo característico de este microscopio es el uso de una muestra ultrafina y que la imagen se obtenga de los electrones que la atraviesan. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.

Microscopio electrónico de barrido (MEB): también emplea un haz de electrones en lugar de un haz de luz para formar una imagen, pero en este caso la muestra es recubierta con una capa de carbón o de un metal y posteriormente es barrida con los electrones acelerados. Tiene una gran profundidad de campo, la cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la muestra. También produce imágenes de alta resolución, que significa que características espacialmente cercanas en la muestra pueden ser examinadas a una alta magnificación.

Microscopios de luz polarizada: son microscopios a los que se les añaden dos polarizadores (uno entre el condensador y la muestra y el otro entre la muestra y el observador). El material que se usa para ello es un cristal de cuarzo y un cristal de Nicol, dejando pasar únicamente la luz que vibra en un único plano (luz polarizada). Esta luz produce en el campo del microscopio claridad u oscuridad, según que los dos nicoles estén paralelos o cruzados.

Microscopio de fluorescencia: es una variación del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos. Microscopio de contraste de fases: permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados. Microscopio de campo oscuro: utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás. Por ello, las porciones transparentes del espécimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partículas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones, incluida la del eje óptico que conecta el espécimen con la pupila del observador.

Forma correcta de enfocar en el microscopio óptico

1-     Colocar el preparado con el cubreobjetos hacia arriba, fijándolo con las pinzas de la platina.

2-    Encender la fuente de luz, no usar el máximo de luz.

3-    Subir la platina utilizando el tornillo macrométrico, mirando por el costado para evitar que la lente rompa el preparado.

4-    Desplazar suavemente la platina, observando por el ocular hasta que aparezca la imagen, obteniendo el enfoque correcto con un leve movimiento del tornillo micrométrico.

5-    Girar el revólver sin modificar la posición de la platina, para cambiar a un objetivo de mayor aumento, mirando por el costado cuidando que la lente no roce la preparación, para evitar que ambas se dañen. Moviendo el micrométrico se logra la nitidez deseada.

Forma de usar el objetivo de inmersión

1-     Colocar una gota de aceite para microscopía sobre el preparado en la zona que desea observar.

2-    Enfocar con el objetivo de menor aumento.

3-    Girar el revólver de modo que el objetivo de inmersión (100X) quede en el eje óptico, cuidando que los otros objetivos no toquen el aceite, pues resultarían dañados.

4-    Subir la platina utilizando el tornillo macrométrico, mirando por el costado hasta que la gota de aceite toque el objetivo de 100X.

5-    Desplazar suavemente la platina, observando por el ocular hasta que aparezca la imagen, obteniendo el enfoque correcto con un leve movimiento del tornillo micrométrico.

·         Técnicas de preparación de la muestra

El material biológico a estudiar debe ser convenientemente tratado para que reúna las condiciones de transparencia, grosor y tamaño adecuadas. Existen dos tipos de preparaciones citológicas: a) temporales: se hacen en el momento y luego se desechan, son fáciles de preparar pero no se pueden conservar por mucho tiempo y no permiten estudios detallados y b) permanentes: se conservan por mucho tiempo, permiten un estudio profundo pero requieren técnicas complejas y prolongadas. En microscopía óptica las técnicas comúnmente empleadas son: 

1.- Frotis o extendido: utilizado para estudiar suspensiones celulares como sangre, bacterias y células de la mucosa bucal. Se coloca una gota de muestra sobre un portaobjetos y se extiende. Se observa directamente o luego de realizar fijación y coloración.

2.- Aplastamiento o “squash”: se coloca el material previamente ablandado entre porta y cubreobjetos y se presiona con fuerza aplastando. Se puede observar directamente o previa fijación y coloración.

3.- Cortes: esta técnica se utiliza para realizar preparados permanentes o temporales. Para preparados permanentes se siguen los pasos detallados a continuación:

·         Fijación:

Se trata la muestra con algún método físico o químico que mata las células pero no altera su estructura y composición. La muestra debe estar seccionada en trozos pequeños que no deben tener más de 0,5 a 1 mm de espesor.

·         Inclusión:

Para que el material pueda ser cortado es necesario infiltrarlo en un material consistente. En microscopía óptica se usa generalmente parafina o celoidina y en microscopía electrónica resinas epóxicas.

·         Corte:

El tejido debe seccionarse en cortes muy finos para permitir el paso de la luz o los electrones (microscopio electrónico). Se hacen con un instrumento llamado micrótomo. Para ser observados en un microscopio electrónico los cortes deben ser ultrafinos (200 Ǻ de espesor) y se utilizan ultramicrótomos.

·         Montaje:

Es la adhesión del material al porta y cubreobjetos, se usa generalmente DePex o Bálsamo de Canadá. En microscopía electrónica el portaobjetos se reemplaza por una rejilla de alambre. • Coloración: para destacar determinadas estructuras. Para preparados temporales en tejidos animales y vegetales, se emplea navaja, bisturí u hoja de afeitar de la siguiente manera: • Se hace un corte en el material para producir una superficie lisa. • Se aplica el filo del bisturí sobre la superficie y se impulsa con suavidad, lenta y uniformemente. • Elementos muy jugosos deben ser fijados previamente con alcohol de mediana concentración. • Las secciones logradas se toman con el bisturí, se depositan junto con una gota de agua en el centro del portaobjetos utilizando un pincel de pelo fino humedecido y luego se cubren con un cubreobjetos. Sustancias utilizadas en las preparaciones para microscopía Fijadores: matan rápidamente a la célula y conservan su estructura y composición química semejante al estado vivo. Fijadores químicos: coagulan o precipitan las proteínas y endurecen los tejidos; los más usados son alcohol etílico y formol. En microscopía electrónica se usa el tetróxido de osmio y el glutaraldehído. Fijadores físicos: detienen los procesos vitales por acción física y los más utilizados son calor, congelación y desecación. Colorantes: tiñen selectivamente ciertas estructuras, dependiendo de su grupo cromóforo (el que da color). Pueden ser: a) Ácidos: son colorantes citoplasmáticos, por ejemplo: eosina y azul de anilina. b) Básicos: son colorantes nucleares, por ejemplo: azul de metileno, azul de toluduina y cristal violeta. c) Neutros: tiñen el núcleo de un tono y el citoplasma de otro, por ejemplo: eosinato de azul de metileno, rojo neutro y rojo fenol. En microscopía electrónica se emplean soluciones de metales pesados como el plomo (Pb). La mayoría de las técnicas de coloración no pueden aplicarse a células vivas.

Reactivos: se utilizan para detectar la presencia de ciertos componentes químicos que interesa identificar reaccionando químicamente con ellos. Por ejemplo el lugol (solución yodo – iodurada), de color pardo, es un reactivo específico del almidón (blanco); al ponerse en contacto originan un nuevo compuesto de color azul violáceo, detectando así la presencia de almidón.

Actividad: fecha de entrega (29/05/2020)

a) busca un vídeo en youtube que te parezca más explicativo en el funcionamiento del microscopio óptico.

b) busca una imagen sencilla de un microscopio óptico e indica las partes.