TP N°6- Enzimas

Fecha límite de entrega: 26 de junio de 2020.-
Todos los trabajos deberán estar incorporados a la carpeta de clases.

Introducción:Para poder comprender mejor este TP deberemos refrescar ciertos conceptos, es por esto que investigarás en la web:

1) ¿Qué naturaleza química poseen las enzimas?

2) ¿Qué función cumplen?

3) Se dice que las enzimas son específicas ¿Qué significa?

4) "La actividad de las enzimas está regulada, así, las vías metabólicas funcionan de modo coordinado y económico, ajustándose a las necesidades de la célula. Esta regulación dependerá de las condiciones del medio ambiente en el que se encuentra dicha enzima". Investiga cuáles son estos factores que afectan la actividad de una enzima.

5) ¿A qué se llama proteína sérica?

6) En el caso de la leche, ¿A qué se refiere con proteína sérica?

Fundamentación:

Las caseínas son las proteínas más abundantes de la leche (alrededor del 80%), el resto se denominan proteínas séricas. Existen distintos tipos de caseínas (a, b y k) y estas pueden asociarse en estructuras cuaternarias complejas. En presencia de iones Ca2+ estos complejos forman agregados esféricos heterogéneos en tamaño y composición, denominados micelas. Más del 90% de la caseína de la leche se encuentra en forma micelar, el resto se encuentra como monómeros o pequeños agregados.

La digestión enzimática de la proteína caseína la realiza una enzima proteolítica, la renina, presente en el estómago de los mamíferos jóvenes (generalmente se la obtiene del estómago de terneros). Dicha enzima se conoce bajo diversos nombres: renina, quimosina, cuajo o fermento. Su rol en la digestión es coagular la leche en el estómago, proceso importante en lactantes.

Así la renina convierte a la leche en un queso, permitiendo que se retenga por más tiempo en el tracto digestivo. Si la leche no se coagulara pasaría muy rápido perdiendo la oportunidad de una buena digestión de sus proteínas. 

La secreción de renina es máxima durante los primeros días después del nacimiento. Cuando el lactante empieza a cambiar su ingesta de leche por otros alimentos sólidos variados, la concentración de renina comienza a disminuir y aumenta la concentración de otra enzima proteolítica, la pepsina y que puede actuar sobre mayor tipo de proteínas.

La reacción por la cual la enzima, renina, actúa sobre su sustrato, la caseína, es la siguiente:

Como se observa, la renina hidroliza sólo en forma parcial a su sustrato la caseína. Esto se debe a que su efecto hidrolítico es absolutamente específico, hidroliza exclusivamente la unión peptídica formada entre estos aminoácidos: fenilalanina y metionina, no pudiendo hidrolizar otras uniones peptídicas. Debido a esta especificidad tan estricta de la renina, ésta ve restringida su acción hidrolítica a tan solo ese particular enlace peptídico presente en la caseína.

La k-caseína es una proteína anfipática que, en presencia de iones Ca2+, se mantiene en suspensión; sin embargo luego de la acción hidrolítica de la renina, su producto: la para-kcaseína se separa, formando el queso. Por lo tanto, la acción de la renina sobre la caseína ocasiona la coagulación de la leche y dando origen a la separación del queso o cuajo, del suero.

Esta acción se emplea en el proceso de fabricación del queso. Es así que la leche, líquida, en su estado físico natural, se coagula por la acción de la enzima renina, al hidrolizar su sustrato, la caseína; dando como productos: la paracaseína, que es uno de los componentes proteicos del queso o cuajada; y la proteosa, que es u La pepsina, en cambio, es otra enzima proteolítica que actúa hidrolizando preferentemente los enlaces peptídicos formados entre un aminoácido aromáticos y cualquier otro aminoácido, por lo que su efecto proteolítico sobre la proteína caseína es mayor que el efecto de la acción dela renina, y además puede hidrolizar a la mayoría de las proteínas.

El pH óptimo de acción de la renina en su actividad proteolítica es entre 3.8 a 4.0 y el pH límite de su actividad es entre 7.3 a 7.5. Mientras que para la pepsina los respectivos pH son entre: 1.8 a 2.0 y 6.6 a 6.7.

ACTIVIDADES (*no las haremos en el laboratorio por obvias razones, pero intentaremos predecir los resultados en función de los anaálisis previos realizados)

1*- Observación de la solubilidad de proteínas de la leche a distintos pH y su relación con el punto isoeléctrico.

2*- Verificación de la acción enzimática de la renina.

3*- Comprobación de la influencia del pH del medio sobre la actividad enzimática de la renina.

Materiales

Se utilizará como material de estudio: leche.

Reactivos

• Agua destilada.
• CaCl₂ (Cloruro de calcio, pro-análisis). Se usará una solución al 12% de cloruro de calcio en ácido clorhídrico 0,1 N.
• NaOH (hidróxido de sódio, pro-análisis). Se usará una solución 0,1 N de hidróxido de sodio en agua destilada.
• HCl (ácido clorhídrico pro-análisis). Se usará una solución 0,1 N de ácido clorhídrico en agua destilada.
• Preparación enzimática. Solución de cuajo.
• Leche fluida de vaca.
• Baño termostatizado

• Tubos medios de ensayo.
• Tapones de goma para tubos de ensayo.
• Pipetas.
• Gradillas para tubos de ensayo.
• Probetas.
• Matraces.
• Erlenmeyers.
• Varillas de vidrio.
• Espátula.
• Frascos de vidrio y de plástico.
• Goteros.
• Marcadores de tinta permanente.

Descripción de la experiencia

q  A 200 mL de leche, agregar 8 gotas de 12% CaCl2 en HCl 0,1 N.

q  Colocar en la gradilla 4 tubos, respetando el orden, las cantidades y los tiempos, según se indican en el siguiente cuadro:

q  Agitar suavemente todos los tubos.

q  Incubar a 45 °C, en un baño termostatizado, durante 15 minutos.

q  Observar todos los tubos y describirlos.

q  Explique lo sucedido en los tubos 2, 3 y 4.

q  Agregue NaOH al tubo 2 y explique lo que sucede.

q  Realice un gráfico utilizando una formula general de un aminoácido que explique los cambios de carga en diferentes pH y muestre el punto isoeléctrico. Cómo se explican estos cambios en una proteína?

Cuestionario

5) Analizar los resultados que esperaría en los tubos 1,2,3,4

6) La pepsina y la renina son enzimas proteolíticas (hidrolizan proteínas) y ambas pueden hidrolizar la caseína (proteína abundante en la leche).

A una muestra de leche, llevada a pH 3, se le agrega renina y se incuba a 37 °C durante 15 minutos. Explique qué ocurrirá. ¿Y si simultáneamente se le hubiera agregado pepsina? ¿Diga cuál de ellas es más específica en su acción y por qué?